以GFP为标记的肝癌细胞RNA转染树突状细胞的体外效应

目的:探讨GFP作为标记观察肝癌细胞RNA转染DCs效果的可行性及肿瘤细胞RNA转染DCs制备疫苗的可行性. 方法:绿色荧光蛋白质粒载体 pGFP-C3稳定转染肝癌细胞HepG2,Trizol法提取筛选后细胞HepG2-GFP总RNA;分离肝癌患者外周血单核细胞体外诱导DCs细胞,总RNA转染DCs,荧光显微镜下观察转染效果,流式细胞仪检测转染前后DCs表型变化;ELISA法检测转染前后上清中IL-12变化情况;MTT法检测效应细胞对靶细胞的杀伤率. 结果:pGFP-C3稳定转染肝癌细胞HepG2后可得到稳定表达GFP的细胞HepG2-GFP,荧光显微镜下呈绿色荧光;总RNA转染的DCs荧光显微镜下呈绿色荧光,CD80(13.2%上升至86.7%),HLA-DR(38.9%上升至97.9%),CD83(0.9%上升至97.1%),CD86(31.2%上升至92.5%)表达明显升高,上清IL-12分泌量ng/L显著增高(61.3±8.1→287.4±29.3,P＜0.05);诱导的CTL能够对肝癌细胞株HepG2起特异性杀伤作用. 结论:GFP可以作为肿瘤细胞RNA转染树突状细胞的观察标记,肿瘤细胞RNA转染DCs可作为一种有效的肿瘤疫苗.     

人胃癌细胞RNA转染树突状细胞诱导特异性抗肿瘤免疫的实验研究

目的：观察人胃癌细胞株RNA转染的树突状细胞（DC）所诱导的行异性抗肿瘤免疫效应，探讨肿瘤细胞RNA直接转染DC进行胃癌生物治疗的可能性。方法：胃癌细胞株AGS体外培养，提取RNA；正常人外周血，进行体外DC的培养扩增；胃癌RNA直接转染DC，MTT法检测胃癌RNA活化DC所诱生的淋巴细胞对胃癌AGS、视网膜母细胞瘤SoRb-70的体外杀伤效应。结果：正常人外周血来源的DC，经胃癌AGS细胞株RNA直接转染后，成功诱导特异性抗肿瘤免疫反应，AGS RNA组CTL在靶效比为20：1时对AGS、SoRb-70的杀伤率分别为84．54％、1．53％，而对照组对这两种细胞的杀伤率分别为1．34％和1．70％。结论：肿瘤RNA转染DC可以诱导特异性抗肿瘤免疫，是一种有前景的胃癌治疗手段，有进一步研究的价值。     

树突状细胞及其负载胃癌细胞总RNA的抗肿瘤作用

目的 以小鼠胃癌细胞总RNA负载树突状细胞(DC),研究其抗肿瘤免疫作用。方法 磁性细胞分选器(MACS)自小鼠脾细胞中分选出CDllc 的DC作短期培养,以小鼠前胃癌细胞株的总RNA脉冲DC,分别以RNA脉冲的DC(RNA/DC)和未脉冲的DC(UDC)皮下注射免疫小鼠2次;免疫后7d,皮下接种小鼠前胃癌细胞MFC 5×105/鼠,以未作免疫注射的小鼠作为对照。接种肿瘤细胞后21d,处死实验动物,测量肿瘤体积,检测自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性和血清IL-12含量。结果 RNA/DC免疫组、UDC免疫组和对照组的皮下肿瘤体积分别为(0.3688±0.6571)、(0.7536±0.3659)、(2.6323±1.1435)cm3。RNA/DC免疫组外周血和脾细胞NK活性均明显升高,较对照组分别高出66.2％和65.4％;其肿瘤特异性CTL也明显升高,较对照组升高49.5％。UDC组NK和CTL活性也明显高于对照组。结论 短期培养的DC和以肿瘤细胞总RNA作为抗原脉冲的DC均可诱导较强的抗肿瘤免疫。     

RNA转染树突状细胞诱导特异性抗前列腺癌免疫反应的实验研究

目的 研究前列腺癌细胞RNA转染树突状细胞(DCs)诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTL)对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用.方法 联合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4 (IL-4) 诱导培养小鼠骨髓单个核细胞向DCs分化,脂质体法转染RNA,流式细胞术测定转染后树突状细胞共刺激分子表达的变化,MTT法测定DCs对T淋巴细胞的刺激能力.ELISA法检测IFN-γ的分泌水平.LDH法测定DCs诱导的CTL对前列腺癌细胞的杀伤效果.结果 用GM-CSF和IL-4诱导培养小鼠骨髓来源的单核细胞,体外诱导培养6 d后获得大量DCs;RNA转染后,DCs表面共刺激分子CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子表达提高(P<0.05),刺激T淋巴细胞增殖能力明显提高(P<0.01);前列腺癌RNA转染的DCs诱导CTL对前列腺癌细胞和肝癌细胞的杀伤作用有明显差异(P<0.01).结论 前列腺癌细胞RNA转染DCs后诱导的CTL对前列腺癌有特异性杀伤作用,为进一步抗肿瘤疫苗的实验研究奠定了基础.     

Study on Anti-mouse Hepatocellular Carcinoma Effect of Cytokine-induced Kill Cells Activated by Dendritic Cells Transfected With Mouse Hepatocellular Carcinoma Total RNA in vitro

目的 探讨转染小鼠肝癌H22细胞总RNA的树突状细胞(DC)疫苗体外抗小鼠肝癌的免疫作用.方法 提取小鼠四肢长骨骨髓,在rmGM-CSF和rmIL-4体外刺激下增殖分化为DC.制备小鼠脾淋巴细胞,在体外经rmIFN-γ、anti-CD3、rmIL-2和rmIL-1b诱导成为细胞因子诱导的杀伤性细胞(CIK细胞).制备肝癌H22细胞总RNA,体外转染DC,流式细胞仪检测转染前后的DC表面分子的表达情况.将转染H22细胞总RNA的DC和CIK细胞混合培养制备成为效应细胞,LDH释放法测定效应细胞对小鼠H22细胞、S180细胞的杀伤活性.结果 经H22细胞总RNA转染后的DC,其MHC Ⅰ类分子、MHC Ⅱ类分子及CD83、CD86表达率明显增高,CD14表达率降低(P＜0.05).转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其对S180细胞的杀伤率(P＜0.05).转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞的杀伤率高于其他各组效应细胞对H22细胞的杀伤率(P＜0.05).结论 转染H22细胞总RNA的DC激活的CIK细胞对H22细胞具有高效而特异性的体外抗小鼠肝癌免疫作用.     

人肝癌细胞总RNA电转染树突状细胞的体外肿瘤杀伤实验

目的:探讨人肝癌细胞总RNA电转染人树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)后诱导特异性效应T细胞及其效应T细胞抗肝癌的特异性.方法:通过密度梯度离心法分离人外周血单核细胞,采用细胞因子体外培养诱导其成为未成熟树突状细胞(Immature Dendritic Cell,imDC)和成熟树突状细胞(Mature Dendritic Cell,mDC).培养肝癌细胞,Trizol一步法提取人肝癌细胞总RNA.通过电转染法将人肝癌细胞总RNA导入imDC内;观测电转染的转染率;采用免疫细胞化学检测电转染前后的imDC形态及其表面标志;通过混合淋巴细胞实验,获取mDC激活的特异性效应T细胞.用MTT法测定效应T细胞的抗肝癌特异性.结果:电转染方法可将人肝癌细胞总RNA导入imDC.电转染前后imDC分子表达无显著差异,mDC的分子表达与imDC相比发生了变化.转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞.效应T细胞可特异性的杀伤人肝癌细胞,而对不相关的MG-63细胞无特异性的杀伤作用.结论:电转染不影响imDC的形态和原有的蛋白表达;转染了人肝癌细胞总RNA的mDC可特异的激活T细胞为效应T细胞;效应T细胞具有抗人肝癌细胞的特异性.     

树突状细胞介导的肝癌免疫治疗实验研究

目的探讨以树突状细胞（DC）为介导的原发性肝癌免疫治疗新方法。方法采用肝癌细胞制备肿瘤细胞性抗原冲击致敏体外培养的DC,体外混合淋巴细胞反应检测抗原致敏DC;刺激同基因T淋巴细胞增殖的能力,观察负载肿瘤抗原的DC;体内外诱导产生肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）及其抗肿瘤能力。结果经肝癌细胞抗原致敏的DC;能诱导较强的自体T细胞增殖,且诱导特异性CTL,该CTL对自体肝癌细胞具有很强的杀伤活性,杀伤率明显高于DC和未经肝癌细胞抗原致敏的DC;激活的CTL及T淋巴细胞的杀伤率,而对非同种肿瘤细胞无明显的杀伤作用,经BEL7402肿瘤细胞抗原致敏的DC;经皮下免疫小鼠可诱导有效的免疫保护作用,可抵抗野生型BEL7402细胞的再攻击,肿瘤生长受到明显抑制,瘤体出现延迟,生长减慢。结论DC具有强大的刺激T淋巴细胞增殖和诱导产生特异性CTL的能力,在体内外均能激发特异性抗肿瘤免疫应答。     

CIK细胞与树突状细胞共培养后抗肿瘤效应的研究

目的观察CIK细胞与抗原刺激的树突状细胞共培养后的增殖情况、免疫表型、分泌的细胞因子水平及抗肿瘤效应的变化。方法无菌采集新鲜脐血,加入细胞因子分别定向诱导培养成DC、CIK细胞,然后将两种细胞混合,分为CIK-A-DC组（试验组）、DC-CIK组和单纯CIK组（对照组）,观察细胞的形态和增殖状况,ELISA法测定细胞因子分泌水平的差异,并测定其对肿瘤细胞的凋亡及杀伤情况。结果共培养后CIK细胞的增殖倍率增高,分泌细胞因子的水平也明显升高。流式检测显示共培养后的CIK细胞对肿瘤凋亡率高,MTT法显示共培养后的CIK细胞杀伤肿瘤的活性增强,且具有抗原特异性。结论树突状细胞可明显增强其相同来源的CIK细胞的抗肿瘤效应,为肿瘤细胞的过继性免疫治疗提供了一个新的方向。     

树突状细胞抗乙肝病毒免疫和抗肝癌免疫

Ｔ细胞介导的免疫应答在抗肿瘤免疫和抗病毒免疫中起主导作用 ,Ｔ细胞的致敏激活和扩增依赖于抗原提呈细胞(ＡＰＣ)提呈相应的抗原多肽和提供共刺激信号 ,分泌Ｔｈ1型应答主导因子 ,诱导机体生成抗原特异性ＣＴＬ ,并通过细胞溶解机制和非细胞溶解机制对肿瘤或病毒产生杀伤或抑制 ,因而ＡＰＣ是启动机体产生抗肿瘤免疫和抗病毒免疫的中心环节 ,能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导。ＡＰＣ包括树突状细胞 (Ｄｅｎｄｒｉｔｉｅｃｅｌｌｓ,ＤＣ)、巨噬细胞、Ｂ细胞等 ,其中ＤＣ是机体最有效、功能最强的抗原提呈细胞 ,…     

甲胎蛋白修饰的树突状细胞诱导抗肝癌免疫作用的研究

目的：研究甲胎蛋白修饰的树突状细胞诱导抗肝癌的免疫作用。方法：选择12例健康志愿者随机分为观察组和对照组（n=6）。对照组采用GM-CSF和IL-4继续培养,观察组加入AFP（甲胎蛋白）阳性的肝癌细胞株Bel-7402。分析两组细胞表型并观察CD80、CD86以及HLA-DR等表达,释放IFN-γ的激活T细胞数以及特异性抗肝癌CTLs的百分率。结果：观察组诱导的DCs成熟表型中CD80、CD86和HLADR的比率均显著高于对照组（P〈0.05）,诱导CTLs结合表位肽A和表位肽B的阳性细胞数也均显著高于对照组（P〈0.05）,而对照组中平均每105个T淋巴细胞可检测到的分泌IFN-γ的斑点数为（11.25±2.33）个,则显著低于观察组（P〈0.05）。结论：甲胎蛋白修饰的树突状细胞在诱导抗肝癌免疫中疗效较好,值得临床推广。     

CIK与树突细胞联合对肾癌细胞的杀伤研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）和树突状细胞（Dc）共同培养后CIK细胞的增殖活性、表型变化及对肾癌细胞株769一P的杀伤作用。方法采集健康人的外周血单个核细胞（PBMC）,置37℃、5％C02培养箱2h,收集非粘附细胞诱导分化成CIK,粘附细胞诱导为DC,在培养7d后DC与CIK按1：40的比例混合培养,分别在3d、6d收集细胞同时以单纯CIK细胞为对照,运用LDH释放法检测对769一P细胞的杀伤活性。结果Dc—CIK共同培养后增殖速度明显快于单纯的CIK细胞,培养第10天时单纯CIK的CD3CD8、CD;cD未双阳性率分别为（50．4±1．8）％、（20．1±5．2）％,共培养3dDC—CIK的CD;CD8＋、CD36＋未的阳性率分别为（67．2±5．2）％、（37．9±4．1）％,6dDC-CIK的CD3＋CD8、CD3CD56的阳性率分别为（75．2±3．1）％、（48．3±2．9）％,表达差异具有统计学意义（P〈0．05）。在1：5—1：40靶效比范围内DC—CIK对肾癌细胞的杀伤活性高于单纯CIK细胞,且随效靶比增强杀伤活性增强（P〈0．05）。结论DC—CIK的增殖活性和细胞毒活性均高于单纯CIK细胞。     

CIK细胞与DC-CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）与树突状细胞（dendritic cells,DC）结合CIK细胞抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0.05）,DC-CIK细胞共培养后,CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0.05）,共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0.01）,DC-CIK细胞对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0.01）。结论 DC-CIK细胞比CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

负载LMP－1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。     

乙肝病毒X基因阻断降低肝癌细胞HepG2.215与纤维连接蛋白的黏附

目的探讨乙肝病毒X基因（HBX）在肝细胞癌（HCC）侵袭转移中的作用。方法利用psiRNA-hH1neo质粒,构建针对HBX的shRNA表达载体psiRNA1、psiRNA2、psiRNA3,转染肝癌细胞株HepG2.215,用荧光定量PCR仪检测siRNA对HBX mRNA表达的抑制作用,用Western blot法检测siRNA对HBX蛋白表达的抑制作用。以Transwell小室测定HepG2.215细胞与纤维连接蛋白（Fn）的体外黏附能力。结果成功构建shRNA表达载体,shRNA表达载体均可不同程度地抑制HBX的表达,其中psiRNA1对HBX的抑制作用最强,对HBX mRNA抑制率达80.27%,对HBX蛋白的抑制率为65.59%;细胞体外黏附能力受到明显抑制,在培养至48、72h后,对照组和转染组跨膜细胞数分别为442.6±57.1vs376.4±55.2和588.2±70.1vs513.6±68.5,两时相点均有明显差异（P〈0.05）。结论阻断HBX的表达可明显抑制肝癌细胞HepG2.215的体外侵袭性生长。     

CIK细胞治疗泌尿系统肿瘤的临床疗效分析

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK细胞）体外细胞毒活性,并观察CIK细胞治疗泌尿系统肿瘤的近期临床疗效、免疫学活性及副反应.方法 2007年7月至2010年3月共收录10例泌尿系统肿瘤患者进行CIK细胞治疗,经标准治疗方案治疗的患者,取外周血分离单个核细胞（PBMC）,体外诱导出CIK细胞培养后,观察CIK细胞表型,用MTT法测体外细胞毒活性.结果当效靶比为16：1、8：1时,CIK细胞体外细胞毒活性杀伤率分别（93.59±6.69）%和（76.78±14.23）%.前列腺癌2例,病情有较好的缓解,其中1例前列腺特异抗原和游离抗原治疗后均下降;4例肾癌完全缓解,1例SF,AFP和CEA在CIK治疗3个疗程后降至正常值.膀胱癌4例,部分缓解3例;与CIK细胞回输前相比,患者CD3＋、CD4＋、CD8＋均有显著升高（P〈0.05）,这表示可以诱导患者产生特异性的免疫反应.10例患者在输注CIK过程中未出现不良反应.结论 CIK细胞在泌尿系统肿瘤免疫治疗中能诱导机体产生特异性的免疫反应,亦是新的杀伤肿瘤细胞的效应细胞,有较好的临床疗效.     

体外诱导白血病细胞向树突状细胞分化的研究

树突状细胞是体内最强的抗原呈递细胞,在免疫系统中发挥着重要的作用。从诱导髓系白血病细胞向树突状细胞分化的实验技术方法、诱导分化的机制及其在抗白血病免疫方面的作用和临床应用进行综述。     

急性髓细胞白血病树突状细胞诱导T细胞对自体白血病细胞毒性作用的研究

目的　研究急性髓细胞白血病 (AML)树突状细胞 (DC)诱导 T细胞对自体白血病的细胞毒性作用。方法　分离 AML 患者外周血单个核细胞 (MNC) ,在含有 GM- CSF、IL- 4、TNF- α等刺激因子的培养体系中培养7～ 14 d,通过形态学和免疫表型鉴定 DC。通过反复冻融的方法获取白血病抗原肽 ,分别以白血病抗原肽及白血病抗原肽 - HSP90复合物方式脉冲 DC,再将 DC与自体 T淋巴细胞共同孵育 ,以乳酸脱氢酶的方法检测经不同抗原方式激活的自体 T淋巴细胞对白血病细胞的杀伤效应。结果　急性白血病患者外周血 MNC中培养出 DC为 (6～11)× 10 4 / 10 6 MNC,经两种抗原方式激活的自体 T淋巴细胞对自体白血病细胞的杀伤活性分别为 (6 2 .0 7±8.2 9) %和 (35 .33± 9.0 4 ) % ;体外培养的 AML 患者外周血 MNC可诱导分化出大量 DC。结论　单纯白血病抗原肽与白血病抗原肽 - HSP90复合物方式脉冲的 DC均能够激活自体白血病特异性 T淋巴细胞 ,但后者具有更强的激活能力。     

长链非编码RNA CCAT1在肝细胞肝癌中的表达及预后意义

目的 探讨lnc RNA CCAT1在肝细胞肝癌中的表达及其临床意义。方法 采用荧光定量PCR检测检测96例肝癌癌灶组织及癌旁组织中lnc RNA CCAT1的表达情况,并分析与各临床病理因素以及患者预后的相关性。结果 lnc RNA CCAT1在肝癌癌灶组织表达升高;肝癌癌灶组织中lnc RNA CCAT1表达量和门静脉癌栓、TNM分期等因素相关。进一步生存分析发现lnc RNA CCAT1表达阳性者术后平均生存时间（32.1个月,95% CI：26.3~38.0个月）明显短于阴性患者（47.2个月,95% CI：42.5~52.0个月）,差异有统计学意义（χ²=7.607,P=0.006）。并且lnc RNA CCAT1表达是肝癌患者总体生存的独立危险因素。结论 lnc RNA CCAT1表达在肝癌发生、发展中发挥重要作用;lnc RNA CCAT1表达是肝癌患者的独立预后因素。