建立非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠人白血病模型的实验研究

目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562,并以此移植非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠,建立白血病研究的新动物模型.方法:用含GFP的逆病毒载体将标记基因GFP转入人白血病细胞株K562.NOD/SCID小鼠经2.5Gy的γ射线照射后,从尾静脉注射0.5×106个K562-GFP细胞(n=3;第1组);或1×106个K562-GFP细胞(n=3;第2组);或生理盐水作为对照组(n=2).移植后第6周用流式细胞术和PCR检测受鼠体内白血病细胞.结果:外源性GFP基因在K562细胞中稳定表达.移植后6周FCM检测,受鼠骨髓中的人源细胞比例均数分别为12.3%(第1组)和22.6%(第2组),并且外周血和脾脏也可检测白血病细胞.结论:用GFP标记的K562细胞移植NOD/SCID小鼠,成功建立了白血病动物模型.     

慢病毒载体感染终末分化骨髓瘤细胞的研究

目的研究慢病毒载体有效转移并表达于终末分化骨髓瘤细胞。方法构建表达GFP(绿色荧光蛋白)及NeoR(新霉素抗性基因)的慢病毒载体,分别感染多发性骨髓瘤细胞J558L。采用荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达,用G418筛选携NeoR慢病毒载体感染的J558L细胞。结果包装的慢病毒滴度达6×105IU/mL,对J558L细胞的感染效率为5%￣10%。通过G418筛选可得到稳定长期表达neo基因的阳性细胞克隆。结论慢病毒载体可有效感染终末分化细胞,是有发展潜力的基因治疗新载体。     

应用珠蛋白启动子驱动荧光蛋白在K562细胞中表达

目的应用红系特异性启动子驱动荧光蛋白（绿色荧光蛋白GFP和红色荧光蛋白RFP）在血液病细胞K562中表达,以验证克隆所得红系特异性启动子的有效性。方法应用PCR的方法扩增红细胞系特异性启动子,构建该启动子驱动GFP基因表达载体和驱动RFP基因表达载体。然后转染K562细胞,用荧光显微镜、RT-PCR分析基因表达的情况。结果荧光显微镜示在K562细胞中可见较强的绿色荧光和红色荧光表达,RT-PCR进一步验证了GFP和RFP能在K562细胞中有效的表达。结论克隆的红细胞系启动子是有效的,能有效地启动目的基因在血液病细胞中表达,为下一步进行血液病基因治疗提供科学的资料。     

病毒及非病毒载体对U937单核细胞的转染效果

目的：比较研究腺病毒、慢病毒和Lipofectamine 2000 3种方法转染U937细胞的效果差异,以寻找一种简便、高效转染U937细胞的方法。方法：分别采用Lipofectamine 2000介导质粒载体（pGPHI/GFP/Neo）,腺病毒（Adv-GFP-NC）和慢病毒（LV-GFP-NC）3种方法转染U937细胞,于脂质体转染48 h后、腺病毒和慢病毒转染96 h后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（green fluorescence protein,GFP）表达情况,并收集细胞以流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例。台盼蓝染色法计数不同转染方法对细胞活力的影响。结果：Lipofectamine 2000介导质粒载体转染组、腺病毒转染组GFP阳性细胞极少,流式细胞仪检测GFP阳性细胞均＜4%;慢病毒转染组GFP阳性细胞满视野,感染复数=100时,GFP阳性细胞约占90%。台盼蓝染色法显示腺病毒、慢病毒组活细胞率明显高于脂质体组,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论：慢病毒不仅使Lipofectamine 2000和腺病毒能有效地将外源基因导入U937细胞内表达,也是转染U937细胞的理想载体。     

人釉原蛋白基因转导对人骨髓基质细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的观察慢病毒介导的人釉原蛋白(hAm)基因转导对人骨髓基质细胞(hBMSCs)增殖及细胞成骨分化标志物碱性磷酸酶(ALP)合成的影响。方法采用RT-PCR技术获取hAm编码基因,扩增产物与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(FUGW)连接构建重组慢病毒载体质粒FUAmW,以聚乙烯亚胺(PEI)法三质粒共转染293T细胞组装获取慢病毒,并感染hBMSCs(目的基因转导组);以感染FUGW和未感染病毒的hBMSCs分别作为对照基因转导组和空白对照组。流式细胞仪测定慢病毒感染效率,RT-PCR鉴定细胞hAm表达;MTT比色法检测细胞增殖;慢病毒感染后第7天,倒置相差显微镜观察各组细胞ALP染色情况;感染后第4、7、10天,采用RT-PCR技术检测各组hBMSCs内ALP mRNA表达。结果目的基因转导组细胞FUAmW的感染效率达40.29%,RT-PCR检测到540 bp的目的基因产物条带;细胞增殖水平显著高于对照基因转导组和空白对照组(P<0.05);慢病毒感染后第7天,目的基因转导组ALP染色阳性细胞数量明显少于对照基因转导组和空白对照组;感染后第4、7、10天,目的基因转导组细胞ALP mRNA表达...     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的 探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点。方法 应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MOI的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系。通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度。结果 发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2d最高,至少可持续9d。Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异。结论 重组杆状病毒可以用于体外基因转导。     

重组杆状病毒载体在哺乳动物细胞中的表达

目的探讨重组杆状病毒作为哺乳动物基因转导载体的可行性及其转导特点.方法应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备重组杆状病毒Bac-GFP,以不同MO1的病毒和不同终浓度丁酸钠感染各哺乳动物细胞系.通过荧光倒置相差显微镜和流式细胞仪观察检测细胞转导率和绿色荧光蛋白(GFP)表达强度.结果发现HEK293细胞中,Bac-GFP转导率和GFP表达强度随着MOI和丁酸钠浓度的提高而显著增高(P<0.01),报告基因GFP的表达第2 d最高,至少可持续9 d.Bac-GFP可感染不同种属不同组织的哺乳动物细胞系,但转导率有差异.结论重组杆状病毒可以用于体外基因转导.     

人釉原蛋白基因转导对人骨髓基质细胞增殖和碱性磷酸酶合成的影响

目的 观察慢病毒介导的人釉原蛋白(hAm)基因转导对人骨髓基质细胞(hBMSCs)增殖及细胞成骨分化标志物碱性磷酸酶(ALP)合成的影响.方法 采用RT-PCR技术获取hAm编码基因,扩增产物与携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体质粒(FUGW)连接构建重组慢病毒载体质粒FUAmW,以聚乙烯亚胺(PEI)法三质粒共转染293T细胞组装获取慢病毒,并感染hBMSCs(目的基因转导组);以感染FUGW和未感染病毒的hBMSCs分别作为对照基因转导组和空白对照组.流式细胞仪测定慢病毒感染效率,RT-PCR鉴定细胞hAm表达;MTT比色法检测细胞增殖;慢病毒感染后第7天,倒置相差显微镜观察各组细胞ALP染色情况;感染后第4、7、10天,采用RT-PCR技术检测各组hBMSCs内ALP mRNA表达.结果 目的基因转导组细胞FUAmW的感染效率达40.29%,RT-PCR检测到540 bp的目的基因产物条带;细胞增殖水平显著高于对照基因转导组和空白对照组(P＜0.05);慢病毒感染后第7天,目的基因转导组ALP染色阳性细胞数量明显少于对照基因转导组和空白对照组;感染后第4、7、10天,目的基因转导组细胞ALP mRNA表达显著低于对照基因转导组和空白对照组.结论 导入外源性Am基因能刺激hBMSCs增殖,但细胞内ALP mRNA表达下调.     

不同基因载体转导人骨髓间充质干细胞比较

目的比较腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体对人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的转导效率。方法体外原代培养hBMSCs,进行腺病毒载体、腺相关病毒载体、杆状病毒载体和质粒载体转染实验。采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测经基因载体转染后的hBMSCs胞内目的蛋白表达情况。结果倒置荧光显微镜观察结果显示,基因载体转染后的部分hBMSCs胞内有GFP表达而发绿色荧光,其中杆状病毒转导的hBMSCs荧光强度较强。流式细胞仪检测结果表明,腺病毒载体、腺相关病毒载体及质粒载体的转导效率和绿色荧光蛋白阳性细胞平均荧光强度分别是42%、37%、22%和158、115、77,均明显低于杆状病毒的70%(P<0.01)和212(P<0.05)。结论杆状病毒载体对hBMSCs的转导效率高于腺病毒载体、腺相关病毒载体和质粒载体,有望成为人体基因治疗研究中更为理想的基因载体。     

携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体的构建及表达

目的 构建携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体,并研究其在CD4+CD25-T细胞中的表达.方法 构建含鼠Foxp3基因及内部核糖体进入位点序列(IRES)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的双顺反子慢病毒载体.采用脂染法将慢病毒载体三质粒转染293T细胞,经共培养法感染免疫磁珠分离的小鼠CD4+CD25-T细胞,流式细胞术(FCM)检测基因转导效率,通过RT-PCR及Western Blotting法分别从mRNA和蛋白水平检测Foxp3的表达.结果 成功构建了慢病毒表达质粒pXZ208-IRES-GFP/pXZ208-Foxp3-IRES-GFP,包装的重组慢病毒滴度达106 IU/mL.以pXZ208-IRES-GFP为阴性对照组,共培养法感染CD4+CD25-T细胞,实验组细胞基因转导效率达55.95%,并且存在Foxp3 mRNA和蛋白水平的高表达.结论 成功构建了携带鼠Foxp3基因的自身失活型慢病毒载体;该系统可有效的介导Foxp3基因在CD4+CD25-T细胞中表达.     

乙肝病毒X基因慢病毒载体的构建和鉴定

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白的重组慢病毒载体pRRLsincPPT-hPGK-X-IRES-eGFP-WPRE(pRRL-X),并感染正常组织来源的人肝细胞HL-7702,以验证其在体外的感染效率.方法 采用PCR技术扩增出HBV X基因的DNA片段,用IN-Fusion技术构建表达载体pRRL-X并鉴定,j...     

人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

摘要：目的  构建含人干细胞白血病（SCL）基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞（ICC）,为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础。方法  通过聚合酶链反应（PCR）将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度。体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数（MOI）值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值。重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC（空载体组）及未转染的ICC（空白组）作为对照,通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测SCL基因在ICC中的表达。结果  经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光。MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组。结论  成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达。

     

稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

目的设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA(shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。方法设计并合成3条编码大鼠GRP78mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达。结果测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3。慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率>85%。经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78mRNA表达的沉默效率分别为69.4%±1.42%、74.7%±1.69%和86.6%±1.73%(P<0.05),含无义序列的阴性质粒LV-Non Target对照组与未处理组相比,GRP78mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致。结论成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型。     

2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞

目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34 细胞与间充质干细胞。方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34 造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率。结果:rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率为5.3%±1.7%。经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%。结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34 细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34 细胞的转染效率。     

人乙酰肝素酶基因启动子驱动的真核细胞表达载体构建、鉴定及功能分析

目的构建人乙酰肝素酶（HPSE）基因启动子驱动的肿瘤细胞特异性表达载体，并分析其活性。方法PCR扩增人类基因组DNAHPSE启动子核心片段，并测序鉴定和分析转录因子结合位点（TFBS）。双酶切插入pEGFP-1的多克隆位点，构建肿瘤细胞表达载体pEGFP-Hp。将经酶切和测序鉴定的重组质粒pEGFP—Hp及质粒pEGFP-1（阴性对照）和pEGFP—N1（阳性对照）分别转染正常人脐静脉内皮细胞（ECV）和不同的肿瘤细胞（肝癌细胞HepG2、喉癌上皮细胞Hep2和慢性白血病K562细胞）。荧光显微镜观察和流式细胞术分析其促转录活性。结果扩增的HPSE启动子核心片段长度为561bp，序列分析与GenBank收录一致，含有3个SPI、4个Ets相关元件、2个早期生长反应基因-1及E47、N—mye和NGFI—p300等TFBS各1个。重组质粒pEGFP—Hp经酶切和测序鉴定与预期结果一致。荧光显微镜观察显示，转染pEGFP-1细胞中均无荧光表达；转染pEGFP—N1细胞均有强荧光表达；转染pEGFP—Hp质粒的ECV几乎无荧光表达，HepG2和Hep2细胞有较强荧光，K562细胞仅有较弱荧光。流式细胞术检测表明，pEGFP—Hp在ECV、HepG2、Hep2和K562细胞的平均转染率分别为3．9％、21．3％、10．8％和6．5％，pEGFP-N1转染率分别为17．1％、24．0％、14．0％和11．0％，二者比值均小于1。结论成功构建了由HPSE核心启动子驱动的真核细胞表达载体，该载体可在肿瘤细胞特异性表达，但其活性需进一步加强。     

慢病毒-SOX9基因载体的构建及其在小鼠骨髓间充质干细胞中过表达的研究

目的构建慢病毒-SOX9基因载体并转染小鼠骨髓间充质干细胞以得到用于基因治疗软骨损伤的种子细胞。方法自Gene bank中获得小鼠SOX9的cDNA序列（NM_011448.4）,设计两端引物,并在其两端分别引入Xhol和BamHI酶切位点序列,用RT-PCR法扩增出SOX9cDNA,连入慢病毒表达载体,构建慢病毒-SOX9-EGFP（Lenti-SOX9-EGFP）重组体。通过Real time定量PCR法测定滴度后使用Lenti-SOX9-EGFP转染小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。采用免疫荧光和Westernblotting鉴定SOX9在mBMSCs中的表达。结果 PCR（445bp）、DNA测序、Western blotting（83KDr）检测证明Lenti-SOX9-EGFP载体构建成功。经Real time定量PCR法测定的病毒滴度为2×108TU/ml。Lenti-SOX9-EGFP转染mBMSCs 72h后经免疫荧光检测约80%的mBMSCs可表达SOX9。Western blotting也证明了SOX9在经SOX9基因转染的mBMSCs内稳定表达。结论获得了稳定表达SOX9的mBMSCs,为基因治疗关节软骨损伤奠定了基础。     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

PAK4基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建PAK4基因RNAi慢病毒载体,并对其在涎腺腺样囊性癌细胞株SACC-83细胞中干扰效率进行鉴定。方法：针对PAK4基因RNAi有效靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeⅠ和EcoRⅠ 酶切后的pGCsil-GFP载体连接产生shPAK4i-LV慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用shPAK4i-LV载体、pHelper1.0载体和pHelper 2.0质粒共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平测定病毒滴度。 结果：PCR扩增出插入片段,测序证实成功构建了PAK4-shRNA慢病毒载体shPAK4i-LV。包装并浓缩慢病毒,滴度为2E+9 TU•mL^-1。将病毒感染SACC-83细胞,real-time PCR检测PAK4的mRNA表达下调70%以上。结论：成功构建了shPAK4i-LV病毒载体并建立了SACC-83-shPAK4i细胞模型,为PAK4在肿瘤信号转导通路中的研究提供工作基础。     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术，建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中，在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组；重组体通过脂质体介导转染293T细胞，并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒，通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度，通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增；应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建；转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光，随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应，经过3轮扩增，病毒达到合适的滴度；受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体，为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。