铜绿假单胞菌外毒素A全长基因的扩增与克隆

目的从绿脓杆菌中提取染色体DNA，PCR扩增及克隆外毒素A全长基因，为实现外毒素A的高效表达奠定基础。方法从绿脓杆菌培养物中提取染色体DNA，PCR扩增外毒素A全长基因，A—T克隆入本室自行构建的pSK—T载体中，对重组质粒进行酶切与测序鉴定。结果与结论成功地从高GC含量的绿脓杆菌染色体DNA中扩增到长片段的外毒素A全基因并进行了克隆与鉴定。     

HSV-1 UL15 exon-Ⅱ的原核表达及抗体制备

目的 构建pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,在大肠埃希菌中高效表达并免疫家兔制备抗体.方法 以HSV-1感染后的Vero细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增HSV-1 UL15 exon-Ⅱ基因,克隆入原核表达载体pQE-31;重组质粒经酶切、测序鉴定无误后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;SDS-PAGE检测蛋白表达情况;表达蛋白用Ni-NTA亲和层析纯化及透析复性处理后免疫家兔制备特异性抗体,抗体的免疫原性用Western blotting进行检测.结果 通过RT-PCR扩增获得了HSV-1 UL15 exon-Ⅱ全长基因;构建的pOE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ重组质粒经酶切及测序鉴定无误;阳性转化菌株经WIG诱导后SDS-PAGE电泳显示表达蛋白的相对分子质量约为43 000,与理论值一致,蛋白表达率约为35%～40%;表达蛋白经纯化及透析复性后免疫家兔获得的抗血清经Western blotting鉴定具有较好的特异性和敏感性.结论 成功构建了pQE-HSV-1 UL15 exon Ⅱ原核表达载体,诱导蛋白表达并进一步用表达的蛋白制备了特异性抗体,为HSV-1末端酶全长基因表达情况的鉴定及最终构建抗病毒组装药物的分子筛选模型奠定了前期实验基础.     

Cathelicidin的特性及其应用

Cathelicidin是在哺乳动物体内发现的一类结构多变的抗微生物肽，因在表达的信号肽与成熟肽之间含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族。Cathelicidin 和防御素一样，也是宿主免疫防御系统的重要组成部分。除了主要的抗菌活性以外，Cathelicidin还具有抑制组织损伤，促进创伤修复，结合内毒素，诱导血管生成等多种生物学功能。在临床耐药菌问题日益严重的今天，进一步了解Cathelicidin的生物学活性和临床作用，无疑将推动整个抗感染治疗事业的发展。     

抑制Blimp-1表达导致浆细胞去分化

目的探讨转录因子Bhmp-1在浆细胞发育中的作用。方法应用慢病毒载体稳定表达针对Blimp-1的siRNA，抑制骨髓瘤细胞J558L中Blimp-1的表达。采用免疫荧光及流式细胞技术观察Blimp-1抑制前后细胞的免疫表型变化，半定量RT-PCR检测XBP-1、J-chain、c-myc、BCMA的变化。结果Blimp-1抑制后，浆细胞表面标志CD138表达显著下降，B淋巴细胞免疫标志CD19表达增加。同时，与浆细胞功能及存活密切相关的XBP-1、J-chain、BCMA基因表达下降，而促进B淋巴细胞增殖发育的c-myc表达上升。结论浆细胞中Blimp-1被抑制后，浆细胞发育程序出现再编程，发生了去分化现象，返回到更早期的发育阶段，提示Blimp-1特异性shRNA有可能用于浆细胞相关疾病的治疗。     

抗绿脓杆菌毒素A单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立

本文采用绿脓杆菌外毒素A免疫BALB/c小鼠取脾细胞与Sp2/0细胞融合,建立了6株分泌单克隆抗体的杂交瘤,分别命名为14F10,23B9,23F1,23C12,,24A6及24B5。其中,23F1及24A6在传代培养中逐渐丧失了分泌抗体的能力,其余4株可稳定地分泌抗体。它们的Ig亚类鉴定;14F10为IgM,23B9为IgC1,23C12为JgG2b,24B5为JgG1。注射入同系小鼠腹腔,可产生高滴度抗体,在夹心ELISA试验中己证实均为抗绿脓杆菌外毒素A特异性的。此外,文中还讨论了在间接ELISA初次筛选中出现的假阴性及假阳性的原因及其排除方法。     

生物信息学教学中学生创新能力培养探讨

生物信息学是一门新兴的交叉学科,其理论和方法不断更新,有助于培养学生的创新能力.结合生物信息学教学实践,从教学团队、教学内容、学生主体作用、实践教学、考核方式等方面,对学生创新能力的培养进行了探索.     

铜绿假单胞菌外毒素A表达载体的构建及可溶性表达

目的 实现铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)全基因的可溶性表达。方法 用基因重组技术构建pMAL-PEA原核分泌型表达载体，并在大肠杆菌BL21中进行表达，然后利用直链淀粉树脂对表达蛋白进行亲和层析纯化。结果 酶切鉴定及测序结果表明pMAL-P2X载体上成功地插入了PEA全基因。用IPTG诱导目的基因表达，表达的融合蛋白量约占细菌总蛋白的20％。表达产物经超声处理后，80％的融合蛋白存在于上清液中，说明实现了PEA的可溶性表达。表达的融合蛋白经亲和层析纯化后进行SDS-PAGE电泳，显示为一条蛋白带，分子量约为112kD。结论成功地对PEA全基因进行了可溶性表达和纯化，获得了稳定表达的工程菌，为深入研究：PEA的致病机制和制备用于免疫导向治疗的重组毒素奠定了基础。     

高温变性对双链DNA分子的损害

高温变性是实验室常用的方法 ,如用煮沸法提取质粒ＤＮＡ ,用煮沸法变性ＤＮＡ检测样品或ＤＮＡ双链探针 ,以及在ＰＣＲ中使用 94℃变性模板等[1～ 3] 。这给我们留下一个强烈印象 :即核苷酸链是耐高温以至可以接受煮沸处理的。基于这一事实 ,最近我们使用煮沸法来灭菌欲无菌保存的ＤＮＡ样品 ,结果意外发现 10 0℃加温处理可以不同程度地损害ＤＮＡ分子 ,引起了我们对高温变性处理双链ＤＮＡ分子的高度重视 ,特设计实验观察高温对ＤＮＡ损害的程度以及高温对不同来源ＤＮＡ的损害是否有差异。现将结果报告如下。1　材料与方法1 1　实验材料…     

肽抗生素hPAB-β在毕赤酵母中的表达与活性鉴定

目的 构建表达人源肽抗生素hPAB-β的重组毕赤酵母,为大量制备hPAB-β奠定基础.方法 用PCR及引物延伸法得到天然及优化的hPAB-β序列,克隆入pPIC9K质粒,转化DH5α大肠埃希菌,用酶切和核苷酸测序鉴定.重组质粒经SalⅠ酶线性化,整合入毕赤酵母GS115中,在DNA,mRNA及蛋白水平鉴定阳性重组子.结果 构建的含天然及优化序列的重组质粒酶切均可得到相应大小的插入片段,与预期相符,测序结果表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转入GS115后,得到7个不同的高拷贝阳性转化子,均能表达重组肽并具有良好的抑菌活性.结论 本研究成功构建含天然及优化hPAB-β序列的重组毕赤酵母工程菌,能够用于肽抗生素hPAB-β的制备.     

抗人肿瘤细胞核仁抗原单克隆抗体的建立及其反应性初步分析

有关研究业已证明,在人恶性肿瘤细胞核仁中,存在具有肿瘤特异性的蛋白质抗原,即人恶性肿瘤相关核仁抗原(简称HMNA)。该类抗原不仅具有重要的肿瘤诊断意义,在肿瘤细胞生物学行为的调控上也可能有重要作用。本研究以人肺癌细胞株A549细胞核仁为抗原,建立了6个分泌抗人肿瘤细胞核仁抗原单克隆抗体(MA1～6)的杂交瘤细胞系。在ELISA分析中,6株McAbs均能与A549细胞、人肺癌细胞和人胃癌细胞核仁起反应,其中反应性较好的有MA2、MA4和MA5。对胎盘细胞(代表正常人体细胞)核仁的反应性则以MA5为高,MA4也显轻度反应,而MA1、MA2、