检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

与接头蛋白Bam32相互作用的蛋白分子的鉴定

目的:研究接头蛋白(adaptorprotein)Bam32在B细胞抗原受体(Bcellantigenreceptor,BCR)信号转导级联反应中的作用。方法:以Bam32全序列为诱饵,应用酵母双杂交技术筛选能与Bam32相互作用的蛋白分子,并用293T细胞共转染和免疫共沉淀法加以证实。结果:应用酵母双杂交技术筛选出能与Bam32相互作用的蛋白分子,其中1个出现强阳性反应的克隆编码酪氨酸激酶Lyn。用293T细胞共转染和特异性免疫共沉淀法证实,Bam32可在哺乳动物细胞中与Lyn共沉淀。应用抗磷酸化酪氨酸抗体检测显示,Bam32与Lyn相互作用可导致Bam32磷酸化。结论:Bam32可同Lyn相互作用,导致Bam32磷酸化,这在激活下游产物的级联反应中可能起重要作用。     

抑制Blimp-1表达导致浆细胞去分化

目的探讨转录因子Bhmp-1在浆细胞发育中的作用。方法应用慢病毒载体稳定表达针对Blimp-1的siRNA，抑制骨髓瘤细胞J558L中Blimp-1的表达。采用免疫荧光及流式细胞技术观察Blimp-1抑制前后细胞的免疫表型变化，半定量RT-PCR检测XBP-1、J-chain、c-myc、BCMA的变化。结果Blimp-1抑制后，浆细胞表面标志CD138表达显著下降，B淋巴细胞免疫标志CD19表达增加。同时，与浆细胞功能及存活密切相关的XBP-1、J-chain、BCMA基因表达下降，而促进B淋巴细胞增殖发育的c-myc表达上升。结论浆细胞中Blimp-1被抑制后，浆细胞发育程序出现再编程，发生了去分化现象，返回到更早期的发育阶段，提示Blimp-1特异性shRNA有可能用于浆细胞相关疾病的治疗。     

内源性胰岛素替代疗法中葡萄糖激酶基因逆转录病毒表达载体的构建

背景由于胰岛细胞分离技术难度较大,目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的构建葡萄糖激酶(Glucokinase,GK)基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为构建具有葡萄糖反应性胰岛素分泌能力的胰岛代理细胞打下基础,可望为糖尿病提供一种更符合生理要求的内源性胰岛素替代疗法。设计非随机非对照的实验研究。地点、材料和干预本研究在解放军第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。将GK质粒(pCMV4-GKZ1)经EcoR1/BamH1双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN,构建逆转录病毒表达载体PLX-GK,用酶切法和测序法对重组体进行鉴定。然后脂质体介导逆转录病毒表达载体PLX-GK转入包装细胞PA317,筛选病毒滴度较高的稳定产毒细胞系,PCR鉴定。主要观察指标①重组逆转录病毒载体构建与鉴定结果。②病毒滴度鉴定及PCR结果。结果成功构建GK基因逆转录病毒表达载体,经酶切及测序证明目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;产毒细胞系的平均病毒滴度为6.8×108CFU/L,筛选出一株病毒滴度为1.8×109CFU/L稳定产毒细胞系PA317/GK,PCR证实GK基因整合入细胞基因组。结论成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的产毒细胞系。     

医学微生物学教学改革的实践研究

本文旨在探讨医学微生物学教学改革的实践及效果.采取的方法有重组更新教学内容,反映学科的知识前沿,加强与学科课程间的横向联系,实验课教学相对独立,开设综合性和探索性实验课,构建医学微生物学教学新体系等.同时,编写配套的教学辅助教材.课程改革后的教学效果受到教学督导组和广大学生以及同行专家的肯定.     

Bmi-1调节干性相关分子转录的初步分析

目的 探讨Bmi-1对肿瘤及胚胎干细胞中干性相关分子转录表达的影响.方法 分别构建鼠源和人源Bmi-1过表达载体pCI-GFP-mbmi1和pCI-GFP-hbmi1;瞬时转染鼠ES细胞CCE和人神经胶质瘤细胞U87;半定量RT-PCR检测胚胎干细胞中Oct-4、Nanog、c-Myc、Klf4和Sox2及肿瘤细胞中CD133、Nestin等干性分子的表达;克隆形成实验检测CCE细胞自我更新克隆形成能力.结果 瞬时转染Bmi-1过表达载体后,CCE细胞中Nanog的表达上调,Oct-4、Sox2和Klf4的表达无明显变化;U87细胞中Nestin和Oct-4表达上调,CD133、Nanog变化不明显;两者c-Myc的转录表达均显著降低;过表达Bmi-1促进CCE细胞自我更新克隆形成.结论 Bmi-1参与了对肿瘤及胚胎干细胞中干性相关分子的转录调节.     

查菲埃立克体P28蛋白抗原免疫印迹调查犬单核细胞埃立克体病

目的　以查菲埃立克体P2 8蛋白抗原免疫印迹法对犬单核细胞埃立克体病作流行病学调查 ,为该病的防治提供依据。方法　收集广东犬埃立克体病发生地的犬血清 ,用基因工程制备的查菲埃立克体P2 8融合蛋白抗原与犬血清作免疫印迹 ,检测犬血清中的抗P2 8抗体。结果　 2 12份犬血清行免疫印迹 ,89份 (42 % )阳性 ;这些阳性反应的血清绝大部分来自广州市和深圳市的野外工作犬 ,而南海市观赏犬的血清均为阴性。广西省南宁市的野外工作犬的 36份标本仅 3份为弱阳性。高水平的P2 8抗体出现在 4～ 10月 ,与当地蜱的活动期平行。结论　犬单核细胞埃立克体病在我国为局部流行 ,蜱可能是该病的传播媒介     

应用细胞工程和转基因技术治疗糖尿病：“胰岛代理细胞”的构建研究

背景：由于胰岛细胞分离技术难度较大，目前糖尿病细胞移植治疗尚缺乏理想的细胞来源。目的：构建具有生理性胰岛素分泌能力胰岛代理细胞系，为糖尿病基因治疗提供有效手段。设计：随机对照的实验研究。地点、材料和干预：本研究在第三军医大学附属新桥医院中心实验室进行。以携葡萄糖激酶(glucokinase，GK)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene，MPIN)的逆转录病毒共同感染人肝癌细胞系HepG2细胞，G418筛选，放免法、Western—blotting及RT-PCR鉴定；挑选联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞进行葡萄糖反应性胰岛素分泌反应的检测，以单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞作对照。主要观察指标：不同葡萄糖浓度条件下，联合表达GK及成熟胰岛素的HepG2细胞培养上清中的胰岛素浓度。结果：G418筛选3周获阳性细胞克隆，放免法、Western—blotting挑选出两个目的基因表达均较强的HepG2细胞1株，命名为细胞克隆“β”；RT—PCR证实细胞“β”中已有两个目的基因的转录；在细胞“β”中获得葡萄糖反应性胰岛素分泌，葡萄糖浓度约1．75-2．00mmol／L时出现胰岛素分泌高峰；而在单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞中，各种葡萄糖浓度引起的胰岛素分泌差异无显著性意义(P&;gt;0．05)。结论：成功构建了具有生理性胰岛素分泌能力的“胰岛代理细胞”系。     

小鼠BCMA基因启动子活性研究

目的:探索B淋巴细胞成熟抗原(BCMA)基因5′上游序列的启动子活性, 为进一步研究BCMA基因的表达调控机制提供实验依据.方法:构建由BCMA基因5′上游-820～ 145、 -607～ 145、 -359～ 145、 -157～ 145、 -93～ 145 5个片段驱动的荧光素酶报告载体pGL3-B820、 pGL3-B607、 pGL3-B359、 pGL3-B157、 pGL3-B93, 通过转染J558L、 293T、 HeLa细胞检测荧光素酶的表达, 观察荧光素酶相对活性.结果:5种5′删除体的转录激活性由大到小为pGL3-B157>pGL3-B607>pGL3-B359>pGL3-B93>pGL3-B820.pGL3-B157在3种细胞中的转录激活能力为J558L>HeLa>293T, 且在J558L中的转录激活能力明显强于Hela和293T细胞.结论:BCMA基因5′上游序列"-820 bp～ 145 bp"具有启动子活性, 核心启动子可能位于-93～ 145区域中.     

LPS诱导B淋巴细胞分化过程中部分基因表达的改变

LPS为1型T非依赖性抗原,可以在没有其他细胞辅助的情况下直接刺激成熟B淋巴细胞的增殖和分化并产生抗体。为了研究LPS诱导B淋巴细胞增殖和分化的调控机制,本研究检测了一些关键蛋白分子及转录因子表达的改变。LPS诱导的原代B淋巴细胞的分化伴随着B淋巴细胞抗原受体(BCR)信号转导相关分子表达的显著降低,说明BCR的功能在浆细胞阶段已处于次要的地位。我们的结果还证明,LPS可以在原代B淋巴细胞有效地诱导被称为“B淋巴细胞终极分化主调控子”的转录因子Blimp-1的表达,并抑制转录因子Bcl-6和BSAP的表达,这一变化同B淋巴细胞的发育同步,可能在诱导增殖与分化的调控中起着关键作用。