大鼠骨髓基质干细胞体外培养

目的：建立分离纯化、快速扩增大鼠骨髓基质干细胞（Bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的方法。方法：用全骨髓接种贴壁法,培养分离纯化大鼠BMSCs,传代扩增、测定生长曲线和贴壁率,形态学观察、免疫细胞化学法鉴定细胞膜抗原。结果：全骨髓贴壁法能有效分离纯化大鼠BMSCs,细胞在10%胎牛血清BMSCs培养基中生长状态稳定,第2代细胞生长曲线呈S型、第2、4、6代贴壁率基本相同,贴壁速度无显著性差别,p〉0.05。CD29、CD44和CD90免疫组化鉴定细胞均呈阳性。结论：全骨髓接种贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMSCs,在含10%胎牛血清的BMSCs培养液中,细胞稳定扩增,可能与细胞培养微环境良好有关。     

两种培养方法在猪自体骨髓间充质干细胞培养的比较研究

目的 比较应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法.方法 取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状.结果 直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形.结论 密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高.体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强.     

不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响

目的 探讨获得大量、高纯度、高活性骨髓间充质干细胞(BMSCs)的有效途径.方法 用密度梯度离心法和贴壁法分离纯化BMSCs,在无血清、含小牛或胎牛血清以及不同体积分数的胎牛血清的培养基中培养,传代扩增,观察各组细胞形态、生长特性,测定生长曲线,免疫细胞化学染色鉴定表面抗原,电镜观察细胞显微结构.结果 密度梯度离心法可获得较纯的原代细胞,但细胞增殖缓慢,容易老化;贴壁法分离的细胞生长增殖迅速,经传代换液,第4代细胞基本纯化;小牛和胎牛血清均能促进BMSCs生长增殖,但在体积分数为0.12的胎牛血清中集落形成率最高(46.50%);细胞表达CD44、CD90,而CD14、CD45阴性;电镜下BMSCs符合干细胞的一般特性.结论 经多次换液、严格控制传代消化时间(2～3 min)和酶浓度(2.5 g/L),采用贴壁纯化法在含体积分数为0.12的胎牛血清L-DMEM培养液中培养可获得大量、高纯度、高活性的BMSCs.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及表型和功能特点

目的 建立体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，探讨其表型和功能特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs，传代扩增，测定生长曲线，通过形态学观察，细胞化学及免疫细胞化学法分析大鼠骨髓MSCs的表型和功能特点。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞，密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs，在含10％小牛血清的L-DMEM中，1、3、5代细胞生长曲线基本相同，增殖快，每传代一次细胞约增加2．2倍。细胞呈均一的成纤维细胞样，表达CD44、CD54、纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ)。加入地塞米松(Dex 10^-8mol／L)、β-甘油磷酸钠(β-GP 10mmol／L)、抗坏血酸(AA50μg／ml)可诱导MSCs分化为成骨细胞，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增高，形成矿化结节。结论 所分离、培养的细胞具有间充质干细胞的表型和功能特点，建立了体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法。     

改良法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的：改良大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）原代分离方法，探讨大鼠MSCs体外培养的适宜条件。方法：比较改良与传统单纯贴壁培养法、密度梯度离心法结合贴壁分离法分离培养大鼠MSCs，观察不同方法获得原代细胞形态及不同代MSCs的生长曲线，流式细胞仪检测细胞表面标记，同时观察不同浓度的胎牛血清（FBS）对MSCs生长曲线的影响。结果：改良单纯贴壁培养法获得的原代细胞贴壁时间早、生长快，与其他两种分离方法差异明显（P〈0.01）；原代MSCs用15％的FBS培养，其增殖明显高于5％、10％及20％的FBS培养；第3代以后MSCs用5%的FBS培养有力于细胞纯化。结论：成功地改良了分离培养大鼠MSCs的方法，配合不同血清浓度培养基可使收获MSCs效率增高。     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

骨髓间充质干细胞分离培养方法改进

目的本实验旨在建立一种体外分离培养、纯化扩增人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法。方法比较单纯的贴壁培养法与密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法分离纯化成年人MSCs。结果成年人MSCs呈均一的成纤维细胞样,不表达造血谱系抗原CD14、CD34、CD45。结论利用密度梯度离心法(采用淋巴细胞分离液)结合贴壁培养法能有效分离纯化成年人MSCs,用此种方法培养的细胞具有MSCs的一般生物学特性。     

人骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的 探讨体外培养骨髓间充质干细胞的一些生物学特性，为利用MSCs进行疾病的细胞治疗提供实验基础。方法 密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，分离纯化人骨髓间充质干细胞，并用马血清诱导分化为脂肪细胞。结果 分离获得了高纯度贴壁生长的MSCs。MSCs原代培养呈均匀分布的集落样生长，呈梭形。细胞传代稳定，在体外连续传代培养9代，未发生形态学改变，无衰老征象；传代培养MSCs（P3）在20％马血清的L—DMEM培养液中分化为脂肪细胞。结论 采用Percoll细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSC，是简便有效使用可行的方法；骨髓MSCs体外增殖和传代能力强，通过离体培养可使体内环境下低丰度的MSCs实现数量扩增；     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

损伤肝组织匀浆诱导间充质干细胞甲胎蛋白和白蛋白的表达

目的：建立分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的方法，探讨损伤肝组织匀浆对MSCs的诱导分化作用。方法：采用密度梯度离心、贴壁培养法分离培养大鼠MSCs，以含10%损伤肝组织匀浆、10%FBS的L-DMEM培养基诱导培养，并在不同时间点采用免疫组织化学方法（SP）检测甲胎蛋白（AFP）和白蛋白（Alb）的表达。 结果：MSCs在含10%损伤肝组织匀浆的10%FBS L-DMEM培养基中培养，呈类上皮样细胞。诱导组在培养7 d时，大部分细胞呈AFP阳性表达（75.2%），与对照组比较差异有显著性(P<0.05)； 诱导培养 14、21和28 d AFP表达阳性率分别为35.2%、12.3%和2.0%，组间比较差异有显著性（P<0.05）；诱导组在培养7 d仅少数细胞Alb呈阳性表达（14.6%），诱导培养14、21和28 d Alb表达阳性率分别为67.6%、88.9%和95.6%，诱导组与对照组比较及不同时间点比较差异均有显著性(P<0.05)。结论：此方法可获得纯度较高MSCs，损伤肝组织匀浆可诱导MSCs表达AFP和Alb。     

3种体外培养方法诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化效果比较

目的：采用3种体外培养方法对骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行诱导分化,探讨体外诱导BMSCs向心肌细胞分化的最佳方法。方法：采用密度梯度离心法结合贴壁培养法体外分离培养大鼠BMSCs,分为5-氮胞苷（5-aza）组、扩张型心肌病（DCM）模型大鼠心肌细胞裂解液组和DCM模型大鼠血清+5-aza组,同时设对照组（同等条件下在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中培养）,观察细胞形态表现,采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫组织化学染色法检测细胞中肌钙蛋白T（cTnT）的表达。结果：密度梯度离心法结合贴壁培养法获得大鼠BMSCs,BMSCs高表达间充质干细胞（MSCs）的特征性表面标记CD44、CD29和CD105,不表达造血干细胞的特征性表面标志CD34;特定诱导条件下,BMSCs可以向成骨细胞及脂肪样细胞分化。体外3种培养方法均可诱导BMSCs表达cTnT,分化为心肌样细胞;5-aza组细胞生长状态差,其余2组细胞生长状态较好,DCM模型大鼠血清+5-aza组细胞中cTnT阳性表达率最高。结论：采用DCM模型大鼠血清联合5-aza诱导BMSCs向心肌细胞分化的效果最佳。     

Biological Characteristics of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Cultured in Vitro

Some biological characteristics of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) cultured in vitro were observed, hMSCs were isolated from bone marrow and purified by density gradient eentrifugation method, and then cultured in vitro. The proliferation and growth characteristics of hMSCs were observed in primary and passage culture. MSCs of passage 3 were examined for the purify by positive rate of CD29 and CD44 through flow eytometry. Human bone marrow MSCs showed active proliferation capacity in vitro. The purify of MSCs separated by our method was higher than 90%. It was concluded that hMSCs have been successfully cultured and expanded effectively. It provided a foundation for further investigation and application of MSCs。     

人乙型肝炎病毒DNA阳性血清对人骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的影响

目的:探索人乙型肝炎病毒感染血清对间充质干细胞向肝细胞分化的影响,为肝细胞移植提供实验基础.方法:体外分离和纯化骨髓间允质干细胞,接种在肝细胞诱导培养基中,刺激干细胞向肝细胞分化.设立4个实验组加入不同血清:A组,5%(体积分数)胎牛血清(FBS);B组,2.5%(体积分数)FBS+2.5%(体积分数)乙型肝炎感染血清;C组,2.5%FBS+2.5%(体积分数)正常人血清;D组,以含10%(体积分数)FBS的LG-DMEM培养液作为对照.诱导培养后,利用免疫组织化学染色检测肝细胞特异性标志,以及感染细胞是否表达乙型肝炎特异性蛋白.应用糖原染色技术检测细胞合成和储存糖原的功能.结果:诱导组的间充质干细胞表达白蛋白(ALB)和甲胎球蛋白(AFP),并具备合成和储存糖原的功能.B组细胞加入感染血清后,扩增能力受到抑制,少量细胞可表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg),但ALB和AFP的表达阳性率以及糖原储存能力与C组相似.荧光共聚焦技术检查可见部分细胞同时表达ALB和HBsAg.结论:骨髓间充质干细胞在特定的肝细胞诱导条件下具有向肝细胞分化的能力;乙型肝炎感染血清可以明显抑制间充质干细胞的体外扩增,但对其向肝细胞分化没有明显影响.     

两种分离方法培养成体大鼠骨髓间充质干细胞的比较分析

目的比较分析目前较简单易行的贴壁培养法和密度梯度离心法培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的效果.方法用贴壁培养法和密度梯度离心法分别培养大鼠MSCs,流式细胞仪检测MSCs的表面标记物.结果贴壁培养法培养的原代细胞较密度梯度离心法培养的原代细胞生长快,但传代细胞这一差异不明显;而密度梯度离心法培养的原代细胞较贴壁培养法培养的原代细胞形态一致,随着传代的增加,贴壁培养法培养的细胞形态逐步趋于一致.流式细胞仪检测示：贴壁培养法培养的细胞：CD29（99.8%）、CD90（99.6%）、CD34（3.01%）;密度梯度离心法培养的细胞：CD29（100%）、CD90（97.1%）、CD34（0.89%）.结论用贴壁培养法和密度梯度离心法都可以得到纯度较高的MSCs,两种培养方法的效果无明显差异.