央芪汤流浸膏敷贴制剂对胃癌动物模型的干预作用研究

目的:通过将央芪汤制作成流浸膏制剂,检测央芪汤流浸膏制剂对胃癌动物模型中瘤体的抑制作用。方法:将人胃癌SGC-7901细胞悬液皮下接种于裸鼠背部皮下,当接种部位肿瘤长至最大径4~5mm时,将裸鼠随机分为四组(10只/组):A组(央芪汤敷贴剂);B组(氟尿嘧啶注射液);C组(央芪汤敷贴剂+氟尿嘧啶注射液);D组(生理盐水对照组)。给药期间观察裸鼠的一般情况及移植瘤的生长状况,连续用药24d,并继续观察4d后,颈椎脱位处死裸鼠,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶法检测bcl-2及caspase-3蛋白。结果:央芪汤流浸膏可明显提高胃癌细胞株SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤的caspase-3蛋白表达,显著抑制SGC-7901在裸鼠皮下移植瘤抗凋亡蛋白bcl-2的表达。结论:央芪汤流浸膏可以明显增加荷瘤裸鼠肿瘤细胞凋亡,有明显差异,表明央芪汤流浸膏可以通过促进胃癌细胞的凋亡达到抗肿瘤的目的。     

SGC-7901/HCPT裸鼠皮下移植瘤的建立和鉴定

目的:建立多药耐药人胃癌细胞裸鼠移植瘤模型并探讨移植瘤的耐药特性。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901和耐药细胞株SGC-7901/HCPT分别接种于裸小鼠左侧背部皮下和右侧背部皮下,在SPF级动物合格环境下饲养,观察肿瘤细胞成瘤情况,用MTT法比较移植瘤细胞对羟基喜树碱的敏感性及免疫组化测定其耐药基因TOPO-Ⅰ表达的变化。结果:SGC-7901和SGC-7901/HCPT裸小鼠移植成瘤率为100%,无自行消退现象。MTT法测定SGC-7901/HCPT和SGC-7901/HCPT/nude的IC50分别为4.686μg/mL和4.381μg/mL,与移植前细胞比较,差异无统计学意义。耐药基因TOPO-Ⅰ表达分别为2.964±0.162和2.953±0.172,差异无著性意义。结论:以SGC-7901/HCPT细胞建立的裸鼠皮下耐药移植瘤模型,仍保持体外的耐药活性和基因表型,为耐药机制和逆转的研究提供了良好的动物模型。     

加味小陷胸汤对接种人胃癌SGC- 7901裸鼠移植瘤生长及Wnt/β- catenin信号通路相关蛋白表达的影响

目的 观察加味小陷胸汤抑制人胃癌细胞株SGC- 7901裸鼠皮下移植瘤生长作用,以及对Wnt/β- catenin信号通路相关蛋白和基因表达的影响,探讨加味小陷胸汤抗胃癌侵袭转移作用的分子机制。方法 构建人胃癌细胞SGC- 7901裸鼠皮下移植瘤模型。药物连续干预4周动态观察移植瘤体积变化,4周后剖取瘤组织称质量,采用Western blot法检测瘤组织β- 连环蛋白（β- catenin）、糖原合成酶激酶- 3（glycogen synthase kinase- 3,GSK- 3β）、原癌基因蛋白（cellular- myelocytomatosis viral oncogene,c- Myc）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）蛋白表达水平;采用RT- qPCR检测β- catenin、GSK- 3β mRNA表达水平。结果 与模型组比较,加味小陷胸汤各剂量组可显著降低SGC- 7901胃癌移植瘤模型裸鼠皮下移植瘤体积和质量（P<0.05）,能显著抑制移植瘤组织β- catenin、c- Myc、VEGF蛋白和β- catenin mRNA表达（P<0.05）,上调GSK- 3β蛋白和mRNA的表达水平（P<0.05）,降低基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）- 2、MMP- 9含量（P<0.05）。结论 加味小陷胸汤能够有效抑制人胃癌细胞SGC- 7901裸鼠皮下移植瘤的生长,并且可以调控与胃癌侵袭转移密切相关Wnt/β- catenin通路的过度激活。     

COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响

目的 研究COX-2基因沉默对人胃癌细胞系SGC-7901裸鼠成瘤的影响.方法 构建靶向COX-2的短发夹状双链RNA(shRNA)的真核表达质粒转染人胃癌细胞系SGC-7901,采用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.15只裸鼠随机分为3组,每组5只,皮下接种胃癌细胞.抑制组接种转染抑制质粒的胃癌细胞;正常对照组接种未转染的胃癌细胞;阴性对照组接种转染阴性对照质粒的胃癌细胞.接种4周后比较各组裸鼠皮下形成瘤体的大体和病理情况并计算抑瘤率.结果 转染靶向COX-2的shRNA抑制质粒后细胞中COX-2的表达被明显抑制,抑制率为70.42%.正常对照组和阴性对照组所有裸鼠均有瘤体形成,平均瘤质量分别为(0.49±0.017) g和(0.49±0.013) g.抑制组仅2只有瘤体形成,平均瘤质量(0.05±0.003) g,与正常对照组相比差别有统计学意义(P＜0.01),抑瘤率为89.8%.结论 运用RNA干扰可以高效特异地抑制人胃癌细胞系SGC-7901中COX-2的表达,COX-2被抑制后SGC-7901的生长和活性也被明显抑制.     

人胃癌裸鼠胃原位种植转移模型的建立和改进

目的：建立人胃癌裸鼠胃原位种植转移模型。方法：用人胃癌细胞SGC-7901悬液接种于裸鼠皮下，形成稳定传代的皮下移植瘤。将皮下移植瘤组织再接种于裸鼠胃浆肌层，观察移植肿瘤的生长状况、移植成功率和自发转移的发生率及组织学变化等生物学特性。结果：肿瘤组织块保留了人胃腺癌的组织学特点，人胃癌裸鼠原位移植模型成瘤率为100％(20／20)，肝脏转移率为45％(9／20)。结论：人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的生物学行学与人胃癌自然生长和转移过程相似，为研究人胃癌转移机制提供了理想的模型。     

MicroRNA-101调控人胃癌细胞系增殖、迁移、侵袭的实验研究

目的 通过实验研究miRNA-101在胃癌中的表达水平,以及对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭力和皮下移植瘤的影响,以探讨将miRNA-101用于胃癌生物靶向治疗的可能性。方法 分子克隆技术构建miRNA-101重组腺病毒表达载体,MTT法检测细胞增殖能力,MilliporeTranswell小室法检测细胞迁移能力,Matirgel法检测细胞侵袭能力,q-PCR定量分析各基因表达水平,使用BALB/c免疫缺陷裸鼠建立胃癌皮下移植瘤模型。结果miRNA-101在胃癌组织中的表达量为（0.661±0.396）,低于所对应的癌旁组织（1.128±0.697）,差异有统计学意义（t=10.091,P＜0.01）。胃正常上皮细胞GES-1中的miRNA-101表达量高于胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901、MKN-45和AGS。miRNA-101对MKN-45细胞的增殖能力呈现明显的抑制作用,对胃癌细胞BGC-823、SGC-7901、MKN-45、AGS的迁移和侵袭均有抑制作用。选取MKN-45细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型后5周,Ad-miRNA-101组肿瘤体积为（333.56±46.71）mm3,小于Ad-EGFP组（806.41±51.83）mm3,差异有统计学意义（t=21.431,P＜0.01）。结论在胃组织中,miRNA-101是一个抑制性miRNA,miRNA-101表达水平下调参与胃癌的发生和发展。miRNA-101将有可能成为胃癌生物靶向治疗的新靶点。     

胃安宁颗粒对肿瘤血管VEGF Ki-67表达影响的实验研究

目的：观察胃安宁颗粒对SGC-7901荷瘤裸鼠血管VEGF、Ki-67表达的影响。方法：将裸鼠皮下接种胃癌SGC-7901细胞后随机分为对照组、阳性药组及胃安宁颗粒大、中、小剂量组,用药后分别计算瘤重系数,并将肿瘤组织进行免疫组织化学染色,检测VEGF、Ki-67表达的情况。结果：胃安宁颗粒大、中剂量均能明显降低荷瘤裸鼠瘤重和瘤重系数（P〈0.05～0.001）,免疫组织化学染色显示,应用胃安宁颗粒后肿瘤组织VEGF、Ki-67的表达有所下降。结论：胃安宁颗粒可能通过抑制VEGF、Ki-67的表达起到抑制肿瘤血管生成的作用,从而达到抗肿瘤的目的。     

SCNN1B与胃癌细胞上皮间质转化相关性实验研究

目的:探讨SCNN1B基因与人胃癌细胞上皮间质转化的相关性。方法:构建SCNN1B过表达载体,稳定转染人胃癌SGC-7901细胞。于裸鼠右前肢皮下接种细胞,制备胃癌裸鼠移植瘤模型。3周后处死裸鼠,观察移植瘤生长情况。分别采用Real-time PCR、Western blot、免疫组化检测移植瘤组织中SCNN1B、E-cadherin,N-cadherin及Vimentin表达情况。结果:SCNN1B过表达抑制胃癌移植瘤增长,提高E-cadherin表达水平,降低N-cadherin和Vimentin表达水平。结论:过表达SCNN1B能够抑制胃癌细胞的生长及上皮间质转化。     

人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型的建立及耐药性检测

目的建立人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤模型,并检测其多药耐药性,为进行肿瘤多药耐药逆转剂的筛选和体内实验研究奠定基础。方法采用皮下接种法建立裸鼠移植瘤模型;观察裸鼠生长状况;移植瘤生长情况;进行瘤重及瘤体积比较;移植瘤P-gp耐药蛋白表达;原代培养细胞,检测移植瘤模型多药耐药性。结果人胃癌SGC7901/VCR裸鼠移植瘤组织病理学检查为低分化腺癌,移植瘤组织原代细胞培养后,P-gp表达强阳性+++,具有多药耐药性,模型建立成功。结论成功建立了人胃癌SGC7901/VCR裸鼠多药耐药移植瘤模型,为胃癌耐药研究提供了较理想的动物模型。     

miRNA-34a 对人胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究 microRNA-34a(mir-34a)在人胃癌细胞中的表达水平及对胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响。方法通过实时定量 PCR(RT-PCR)检测人正常胃黏膜上皮细胞 GES 及人胃癌细胞株 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平。体外将表达人 mir-34a ( has-mir-34a)慢病毒感染人胃癌 SGC-7901细胞。荧光显微镜观察评估细胞感染情况,MTT 实验、流式细胞术检测感染后胃癌SGC-7901细胞的增殖、细胞周期及凋亡情况。结果胃癌细胞 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平较正常胃黏膜上皮细胞 GES 明显降低,其中以胃癌 SGC-7901细胞降低最为明显(P <0．01)。与阴性对照组相比, mir-34a 感染组 SGC-7901细胞增殖明显减慢( P <0．01), G1/ G0期细胞比例显著增加(P <0．05),细胞凋亡率显著升高(P <0．01)。结论 mir-34a 在多种人胃癌细胞,尤其是SGC-7901细胞中呈低表达。 mir-34a 可以抑制胃癌 SGC7901细胞的增殖,诱导细胞周期停滞及细胞凋亡。     

人参皂甙Rg3在体外对胃癌细胞生长和凋亡的影响

目的 研究人参皂甙Rg3在体外对低、中分化胃腺癌细胞株MKN-45和SGC-7901生长及凋亡的影响。方法 取处于对数生长期的MKN-45和SGC-7901细胞,加入不同终浓度（20、30、40、50 μg/mL）的人参皂甙Rg3分别培养24、48 h或24、48和72 h,以不加药细胞作为阴性对照。MTT法检测MKN-45和SGC-7901细胞生长抑制率;流式细胞仪Annexin V/PI双染法检测SGC-7901细胞凋亡率;流式细胞仪分析SGC-7901细胞周期;透射电子显微镜观察50 μg/mL人参皂甙Rg3处理组SGC-7901细胞的形态学改变。结果 人参皂甙Rg3各处理组SGC-7901和MKN-45细胞生长抑制率均明显高于对照组(P<0.05),且随药物浓度的增加和作用时间的延长而上升(P<0.05)。与对照组比较,人参皂甙Rg3各处理组SGC-7901细胞凋亡率和G0/G1期细胞百分比均明显上升,且呈浓度和时间依赖性。透射电子显微镜观察50 μg/mL人参皂甙Rg3处理组SGC-7901细胞,可见典型的凋亡细胞结构。结论 人参皂甙Rg3在体外对胃癌细胞生长具有抑制作用,且呈现一定的时效和量效关系,其机制可能与诱导胃癌细胞凋亡有关。     

血管生成抑制剂NM-3抑制胃癌生长机制研究

目的:研究血管生成抑制剂NM-3对胃癌生长的影响,探讨其抑制胃癌生长可能存在的分子机制。方法:建立人胃癌裸鼠皮下种植模型。将40只荷瘤裸鼠随机分成4组,种植后第2 d开始分别腹腔内注入生理盐水(2 ml/kg,对照组)、NM-3(剂量分别为10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg,治疗组),每周2次,共6周。第7周处死动物,测量皮下肿瘤体积、计算抑瘤率;取瘤组织行免疫组化染色测定微血管密度(MVD)、胃癌细胞凋亡指数(AI)。结果:NM-3剂量为10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的皮下肿瘤体积分别为(915.46±39.66)mm3(、871.26±38.84)mm3(、812.27±32.59)mm3,明显低于生理盐水对照组(1 609.55±41.32)mm3(P<0.05),抑瘤率为43.20%、45.87%、49.53%;和生理盐水组比较,NM-3治疗后肿瘤的微血管密度明显减少,胃癌细胞的凋亡指数显著增加(P均<0.05),且与治疗剂量有关。结论:NM-3可通过抑制肿瘤微血管生成,诱导胃癌细胞凋亡,抑制体内人胃癌生长。     

胰岛素样生长因子结合蛋白7基因在胃癌细胞中的表达及甲基化调控

目的 研究胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)mRNA在胃癌细胞中的表达及其甲基化调控.方法 分别培养胃癌细胞株高分化MKN-28、中分化SGC-7901和AGS、低分化MKN- 45以及胃黏膜正常上皮细胞(GES-1).提取细胞RNA,采用RT-PCR法检测IGFBP7 mRNA在各细胞株中的表达.提取细胞基因组DNA,甲基化修饰后采用甲基特异性PCR(MSP)分析其CpG岛甲基化状态.采用不同浓度去甲基化药物5'-杂氮-2'-脱氧胞嘧啶(5-aza-dc)处理细胞株后,经Real-time PCR定量药物处理前后各细胞株IGFBP7 mRNA的相对表达量.结果 各肿瘤细胞株中IGFBP7 mRNA表达较GES-1降低或消失.MSP检测IGFBP7 mRNA表达降低和消失的细胞株均有CpG岛不同程度的甲基化.不同浓度5-aza-dc处理细胞后,IGFBP7 mRNA的表达量呈剂量依赖性增高.结论 IGFBP7 mRNA在胃癌细胞株中低表达或不表达,其表达下调与其CpG岛甲基化有关.5-aza-dc可使IGFBP7 mRNA表达降低的胃癌细胞株重新表达IGFBP7 mRNA,提示IGFBP7基因CpG岛甲基化可能是IGFBP7在胃癌细胞系中表达缺失的分子机制.     

VEGF165表达载体的构建及其对人胃癌生长的作用

目的构建血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF165）真核表达载体,研究其对胃癌生成的作用. 方法用DNA重组方法,将编码VEGF165的全长cDNA克隆于pcDNA3载体中,构建VEGF165 mRNA真核表达载体;用阳性脂质体介导的基因转染技术,将重组体转入人胃癌细胞（SGC-7901）省系;观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学指标. 结果斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,正义VEGF基因转染技术可使VEGF的表达得到明显地加强. 与未转染细胞相比,转染细胞的G2/M期细胞增加(0.44)而S期细胞减少(0.17),克隆形成率(9.0%)明显高于未转染细胞(4.0%). 瘤细胞接种裸鼠后33 d,过表达VEGF人胃癌细胞所致的移植瘤体积（2351±638) mm3明显大于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF可以通过加强肿瘤组织血管生成而促进肿瘤的生长,另外,VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.     

靶向COX-2的siRNA抑制三种不同分化程度胃癌细胞生长及作用机制

目的:利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术在体外抑制COX-2表达,研究其抑制三种不同分化程度的胃癌细胞(MKN-28,SGC-7901,BGC-823)的可能性,探讨RNAi抑制胃癌生长与胃癌细胞分化程度的相关性. 方法:设计靶向COX-2基因的siRNA,构建重组表达质粒pTZU6 1-siRNA-COX-2并导入胃癌细胞株,体外诱导RNAi,采用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blotting检测COX-2基因表达变化,MTT法检测细胞活力,原位末端标记(TUNEL)及透射电镜检测细胞凋亡,Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的改变. 结果:pTZU6 1-siRNA-COX-2质粒导入细胞后,SGC-7901和BGC-823中COX-2表达明显下调,细胞生长被抑制,并出现特征性的细胞凋亡,同时有Bax蛋白上调和Bcl-2蛋白下调. 对照组则无明显变化. 结论:RNAi显著抑制胃癌细胞生长,可能与下调COX-2基因表达和诱导细胞凋亡有关,其对中分化胃癌细胞的抑制作用最为显著,提示RNAi的作用可能依赖于胃癌细胞的分化程度.     

下调胃癌细胞PDGF-D表达对共培养HUVECs生长和功能的影响

目的：探讨通过RNA干扰下调血小板源性生长因子-D（PDGF-D）基因在胃癌SGC-7901细胞中的表达对与其共培养的脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）生长和功能的影响.方法：构建靶向PDGF-D的短发夹状RNA（shRNA）真核表达载体,转染胃癌SGC-7901细胞后,通过RT-PCR,Western Blot检测干扰前后PDGF-D的表达;用ELISA法检测培养液上清中血管内皮生长因子（VEGF）的含量;将胃癌细胞SGC-7901与HUVECs共培养后,细胞计数法检测细胞生长变化,流式细胞术测量细胞周期变化,血管形成实验检测HUVECs的血管形成能力.结果：PDGF-D-shRNA1,PDGF-D-shRNA2重组载体均能使SGC-7901细胞中PDGF-D基因在mRNA和蛋白水平上的表达明显下调（P〈0.05）,且后者抑制效果更好;干扰后胃癌细胞培养液上清中的VEGF下降;与转染后的SGC-7901细胞共培养的HUVECs生长速度明显变慢,且无管状结构形成.结论：重组真核载体能有效抑制SGC-7901细胞的PDGF-D表达,并通过减少VEGF的表达来抑制HUVECs生长和血管形成能力.     

VEGF165反义RNA表达对人胃癌细胞恶性生物学行为的影响

目的利用本室构建的反义VEGF165（血管内皮生长因子,vascular endothelial growth factor）真核表达载体,研究VEGF反义RNA表达对人胃癌细胞生物学表型的影响. 方法用阳性脂质体介导的基因转染技术,将VEGF反义RNA重组体转入人胃癌细胞系,观察转染细胞的细胞周期、增殖能力及致瘤生长情况等生物学表现. 结果 VEGF反义RNA重组体转染胃癌细胞后,斑点杂交、间接免疫荧光等分析显示,反义RNA基因转染技术可使VEGF的表达明显减弱;与未转染的细胞相比,G2/M期细胞增加(0.39),而S期细胞减少(0.54);克隆形成率(2.2%)低于未转染细胞(4.0%);肿瘤细胞接种裸鼠后33 d时,VEGF反义RNA表达人胃癌细胞所致的移植瘤体积（345±136) mm3明显小于未转染细胞所致的移植瘤体积（1534±363) mm3. 结论 VEGF反义RNA可以通过抑制肿瘤组织血管生成而防治肿瘤的生长,另外VEGF的表达可能与细胞增殖能力有关.