阿尔茨海默病的外周机制和防治途径

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）以进行性认知功能减退为主要表现,是最为常见的神经系统退行性疾病。AD 患者脑内的主要病理变化包括β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）在细胞外沉积形成的老年斑、异常磷酸化Tau 蛋白在细胞内聚集形成的神经原纤维缠结、淀粉样血管病和神经元丢失。传统观点认为,AD 是一个大脑自身异常的疾病,因此过去AD 防治策略的重点在于使药物进入脑内而发挥干预作用。近年来的研究表明,AD 患者中Aβ沉积也存在与外周脏器组织如心脏和肠道,我们的工作也发现外周脏器的功能状态与Aβ代谢相关,外周脏器组织在脑内Aβ清除上发挥重要作用。我们新近证实,来源于外周血液的Aβ也能进入正常小鼠脑内,诱发AD 特征性病理变化、损害神经功能。腹腔透析可以降低AD 小鼠血液Aβ水平,改善脑内微环境,促进脑内Aβ清除。这些发现提示,AD 可能是一个系统疾病,需要从系统这一新的角度来理解AD 发生机制、寻找AD 防治措施。     

MicroRNA-195 在长期脑低灌注诱发认知功能障碍中的作用及分子机制

由各种原因引起的长期脑低灌注（chronic brain hypoperfusion,CBH）被认为是轻度认知障碍（mild cognitive impairment,MCI）的临床前病理表现,MCI 会引起患者的认知功能障碍,进一步发展为阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）或血管性痴呆（vascular dementia,VaD）。目前尚无有效的治疗药物,早期干预被认为治疗AD 或VaD 的有效措施。VaD 和AD具有相似的病理学特征：在细胞外表现为β- 淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积所引起的老年斑、在细胞内表现为tau 蛋白过度磷酸化所引起的神经纤维缠结,此外还包括神经元轴突和树突的退化。我们的研究发现采用双侧颈总动脉结扎（2VO）8 周构建大鼠CBH 动物模型表现为学习和记忆能力的下降。随后研究表明：CBH 可引起海马和皮层miR-195 的表达下调,下调的miR-195 会上调淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）及APP β裂解酶1（Beta-secretase 1,BACE1）的表达,引起Aβ的聚集;下调的miR-195 在通过促进Aβ的生成促进LCMT-1 表达的同时转录后调节PME-1 表达,从而参与CBH 大鼠海马区蛋白磷酸酯酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）活性的调节过程,并通过诱导Aβ的生成激活CDK5/P35 向CDK5/P25 的转化协同靶向调节cdk5r1 的转录后翻译促进了tau 蛋白过度磷酸化过程。进一步研究发现CBH 通过下调miR-195 激活N-APP/DR6/caspase6/ caspase3 信号通路,诱导神经元树突退化和神经元的死亡。结论：miR-195 以多靶点调控方式调节Aβ级联反应过程,在CBH诱发认知功能障碍的过程中发挥重要作用。     

CIP2A 在阿尔茨海默病发病中的作用和机制研究

目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是最常见的老年痴呆症,其特征性病变是过度磷酸化的tau 蛋白聚集形成的神经元纤维缠结（neurofi brillary tangles,NFT）和β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积形成的老年斑（senile plaques,SP）。蛋白磷酸脂酶2A（protein phosphatase 2A,PP2A）在AD 脑中活性抑制并参与调节tau 蛋白和Aβ前体APP 磷酸化,从而促进tau 病变和淀粉样病变,但PP2A 抑制的上游机制未阐明。癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A) 是一种新发现的内源性PP2A 抑制子,其在脑中的功能和在AD 发病中的作用到目前为止无相关报道。本研究旨在阐明CIP2A 是否通过调节PP2A 参与AD 样病变及其机制,为AD 的防治提供新的分子靶点。方法：在人脑样本,用免疫印迹检测AD 病人和对照组CIP2A 的表达;在细胞水平,在HEK-tau,N2a-APP 和原代神经元过表达CIP2A,检测tau 病变、淀粉样病变和突触退变损伤;在整体水平,采用腺病毒注射感染C57 小鼠,检测认知功能、tau 病变、淀粉样病变和突触退变损伤情况。结果：CIP2A 在AD 脑内表达水平增高并与PP2A 活性负相关;在HEK-tau 细胞和原代神经元中过表达CIP2A 导致PP2A 活性下降,tau 蛋白过度磷酸化并在树突和树突棘中聚集,树突棘数目减少,突触功能障碍;在N2a-APP 细胞中过表达CIP2A 导致APP 磷酸化,Aβ产生和释放增加;整体动物海马注射AAV 过表达CIP2A 导致动物出现AD 样空间学习记忆能力障碍,脑中出现tau 病变,Aβ产生增加,神经元退变。结论：CIP2A 通过抑制PP2A 活性参与调节tau 蛋白和APP 磷酸化,从而促进AD 样tau 病变、淀粉样病变和神经退变。因此,抑制CIP2A 可能底物特异性活化PP2A 从而逆转AD 样病变。     

阿尔茨海默病脑糖代谢障碍和胆碱能神经元退变机制

目的：针对脑β- 淀粉样蛋白沉积（β-amyloid,Aβ）和Tau 异常聚集的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）治疗的临床试验先后失败,我们有必要重新审视和理清AD 主要病理生理特征（Aβ沉积、Tau 异常磷酸化、脑糖代谢下降和神经元/ 突触丢失）之间的关系,寻找新的干预靶标。方法：利用二脱氧葡萄糖和匹茨堡化合物B 正电子断层扫描（FDG-PET 和PiB-PET）检测AD 患者和认知功能正常对照者脑葡萄糖代谢和Aβ沉积,利用高效液相色谱荧光检测方法检测人血、体外培养细胞和模型动物血与脑组织硫胺素代谢物水平,利用饮食剥夺硫胺素、基因敲减方法等制备硫胺素代谢障碍动物和细胞模型,高尔基染色、免疫组化、免疫印迹、电生理、水迷宫等方法研究模型动物和神经元等细胞形态学、生化指标和功能状态。结果：AD 患者全血硫胺素活性形式——二磷酸硫胺素（Thiamine diphosphate,TDP）水平显著降低且与脑葡萄糖代谢显著相关,而AD患者脑Aβ沉积与血TDP水平无统计学关系。硫胺素缺乏小鼠脑糖代谢显著低于对照小鼠,并与脑、血TDP 水平显著相关。6 个月、10~12 个月APP/PS1 转基因小鼠脑内Aβ斑块和可溶性Aβ水平显著高于野生型小鼠,而脑糖代谢、基底前脑胆碱能神经元数目却与野生型小鼠并无统计学区别,也与血和脑TDP 水平无显著相关。硫胺素缺乏显著增加模型小鼠脑胰岛素抵抗、磷酸化Tau 水平,导致内侧隔核胆碱能神经元及其突起显著减少、骨成形蛋白-9 减少,过表达骨成形蛋白-9 可显著减少硫胺素代谢异常导致的胆碱能神经元及其突起的减少。硫胺素焦磷酸激酶拮抗剂和RNA 干扰显著降低细胞内TDP 水平并减少树突棘密度。初步的临床病例研究结果显示,硫胺素衍生物苯磷硫胺能长期改善AD 患者的认知功能、其作用独立于脑内Aβ沉积。结论：AD 脑糖代谢、胆碱能神经变性和功能损害独立于脑内Aβ沉积,与硫胺素代谢障碍导致的脑胰岛素抵抗、Tau 异常磷酸化和骨成形蛋白-9 下降密切相关。我们的研究为AD 的疾病修饰治疗和临床诊断标志物研究提供了新的视角。     

沉默信息调节因子1 对抗APP 高表达转基因小鼠脑组织及β- 淀粉样肽寡聚体处理的原代培养神经元中氧化应激水平升高的作用

目的：由于氧化应激水平升高是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的可能性发病机制之一，而沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的功能与抗氧化有关，本文试图了解SIRT1 是否能对抗β- 淀粉样肽前体蛋白（APP）高表达的小鼠大脑或经β- 淀粉样肽寡聚体（AβOs）处理的神经元中氧化应激水平的升高。方法：APP/PS1 双转基因种鼠与野生型（WT）雌鼠合笼繁殖，筛选出APP/PS1 双转基因小鼠，分别饲养至4 月龄或8 月龄时，用白藜芦醇（RSV，SIRT1 激活剂）或苏拉明（SIRT1 抑制剂）通过灌胃方法处理转基因小鼠，每次20 mg·kg-1 体重/ 天，时间2 个月；采用原代海马神经元培养，用0.5 μmol·L-1 AβOs 处理48 小时后分别用20 μmol·L-1RSV 或300 mg·mL-1 苏拉明处理细胞24 小时。采用CCK-8 方法检测细胞存活率，筛选最佳药物处理浓度；用蛋白印记及实时定量PCR 方法分别检测SIRT1 蛋白和mRNA 表达水平；用免疫组织化学方法检测APP 高表达转基因小鼠脑组织内老年斑分布情况；用激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测原代海马神经元中活性氧（ROS）水平；用生物化学方法检测小鼠脑组织及细胞中OH-、H2O2、O2.- 水平，丙二醛（MDA）含量，以及超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果：与WT 小鼠或未经处理的原代神经元相比，APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中SIRT1 的表达显着降低；小鼠脑组织中老年斑数量明显增加；脑组织及培养神经元中氧化应激水平明显升高，抗氧化酶水平明显降低。APP/PS1 小鼠大脑或经AβOs 处理的神经元中这些异常改变可通过RSV 处理后减弱，而用苏拉明处理后则使其增强。结论：SIRT1 可以降低APP 高表达小鼠大脑及经AβOs 处理的神经元中的氧化应激水平，具有神经保护作用。     

二氮嗪对Alzheimer病模型大鼠行为学及其相关凋亡因子的影响

目的   建立β-淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）致Wistar大鼠阿尔茨海默病(AD)模型,探讨二氮嗪干预后大鼠行为学及其相关凋亡因子表达的变化。方法   大鼠双侧侧脑室注射Aβ1-42两周后诱导建立AD模型,部分大鼠同时注射二氮嗪干预。通过Y型迷宫电刺激评价大鼠学习和记忆能力,采用蛋白电泳方法检测大鼠大脑皮层和海马部位神经细胞内凋亡因子（Bcl-2）、半胱天冬氨酸蛋白酶 3（Caspase-3）表达水平的变化。结果  与正常对照组和生理盐水组比较,Aβ1-42组大鼠学习记忆能力下降,大脑皮层和海马部位神经细胞Bcl-2表达量减少,Caspase-3表达量增加（P<0.01）。与Aβ1-42组比较,二氮嗪+ Aβ1-42组大鼠学习记忆能力有所提高,神经细胞Bcl-2表达量增加,Caspase-3表达量减少（P<0.05）。结论  二氮嗪能提高Aβ1-42组大鼠的学习记忆能力,可能具有抗细胞凋亡的作用。     

高尿酸血症促进大鼠海马组织中β-淀粉样蛋白沉积的机制研究

目的： 观察血清尿酸水平对大鼠认知功能和海马组织中β-淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）表达的影响,并探讨其相关机制。方法： 将24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、低剂量模型组、中剂量模型组和高剂量模型组,每组6只,后3组采用酵母膏饲料喂养联合不同浓度氧嗪酸钾腹腔注射的方法制备高尿酸血症动物模型,共4周。通过Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力;通过ELISA和蛋白免疫印迹法检测各组大鼠海马组织中Aβ及Aβ生成和清除途径中关键蛋白的表达水平。结果： 与对照组相比,各模型组尿酸水平均明显升高（P<0.01）;4组大鼠穿越平台次数及在平台象限停留时间无明显差异。与对照组相比,各模型组大鼠海马组织中Aβ1 42、淀粉样肽前体蛋白（amyloid precursor protein,APP）、β-分泌酶1（β-site APP cleaving enzyme 1,BACE1）、中性肽链内切酶（neprilysin,NEP）、胰岛素降解酶（insulin degrading enzyme,IDE）表达均增加,且随血清尿酸水平的增加而升高;而ATP结合转运蛋白G超家族成员2（ATP-binding cassette transporter G2,ABCG2）表达则减少,且随血清尿酸水平的增加而逐渐降低。结论： 高尿酸血症能促进大鼠海马组织中Aβ沉积,可能通过APP-BACE1途径增加Aβ的生成或ABCG2途径减少Aβ清除,而不是通过NEP、IDE降解途径减少Aβ降解;高尿酸血症对大鼠认知功能无明显影响。     

二苯乙烯苷通过影响APP 代谢途径减少斑块沉积进而影响学习记忆功能

目的：评价二苯乙烯苷（2,3,4’,5-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside,TSG）在长期给药过程中对APP/PS1 小鼠学习记忆功能的影响及其对阿尔茨海默病病理改变的影响,同时比较其与多奈哌齐药效学及药理作用的不同。方法：给APP/PS1 小鼠灌胃给药（TSG,50 mg·kg-1,100 mg·kg-1;donepezil,1 mg·kg-1）在给药后用Morris 水迷宫实验,新物体识别实验,自主活动,评价小鼠的学习记忆功能及小鼠的活动性。硫磺素染色和Aβ40/42 免疫荧光共定位观察全脑斑块沉积,免疫组化染色观察皮层和海马部位斑块沉积情况,ELISA 方法检测脑内可溶及不可溶Aβ42 的含量,用Western Blot 方法检测皮层及海马部位Aβ生成及代谢途径的关键酶的含量,以此来判断TSG 药物在改善老年痴呆的作用及其作用的关键点。结果：Morris 水迷宫实验结果显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比逃避潜伏期明显延长,给药后逃避潜伏期明显缩短,TSG 与DON 相比,逃避潜伏期更短。新物体识别实验显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比分辨指明显缩短,给药后分辨指数提高,TSG 与DON 相比,分辨指数明显提高。硫磺素染色与Aβ40/42 免疫荧光共定位,斑块能够完全重合,说明斑块的主要成分是Aβ40/42,实验结果统计分析APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比脑内斑块显著,给药后全脑斑块减少,以小剂量最为显著,Don 也能减少斑块沉积,减少程度较TSG 稍差。免疫组化染色皮层斑块沉积,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比皮层斑块显著,给药后皮层斑块减少;免疫组化染色海马斑块沉积,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比海马斑块显著,给药后海马斑块减少。另外Western Blot 检测了Aβ代谢通路,前体蛋白和关键代谢酶,给药后APP,BACE-1,PS1 表达量减低。用ELISA 方法检测脑内可溶及不可溶性Aβ42 的含量,结果显示APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比可溶性Aβ42 含量明显增高,给药后有一定程度减低;不可溶性Aβ42,APP/PS1 模型组与Wild Type 对照组相比明显增加。给药后不可溶性Aβ42明显减低,DON 对不可溶性Aβ42 的脑内含量减低,效果与TSG 相比不明显。结论：TSG 在长期给药后能够改善小鼠的空间学习记忆功能,对斑块所导致的记忆功能减退,有显著的提高作用,而与TSG 相比DON 的改善学习记忆能力更为显著。TSG 对小鼠的活动能力无不良影响。TSG 能够减少斑块沉积,其中不可溶性Aβ42 减低最为明显。进一步研究Western Blot 结果显示TSG 能够减少APP 的表达,在板块生成途径能够影响关键代谢酶BACE-1 和PS1。TSG 长期药效优于DON。     

胰岛素抵抗大鼠脑组织APP代谢及其相关酶的表达及吡格列酮的干预效果

目的观察胰岛素抵抗（IR）大鼠脑组织β 淀粉样蛋白（Aβ）、淀粉样前体蛋白（APP）及其代谢相关酶的表达及吡格列酮(PIO)的干预效果。方法从45只Wistar大鼠中随机选取10只作为对照组（NC组）,35只给予10%果糖水诱发胰岛素抵抗,4周后根据胰岛素抵抗指数（IRI）,将制作成功的胰岛素抵抗模型26只大鼠随机分为IR组、PIO组。PIO组灌服吡格列酮（10?mg·kg-1·d-1）12周,IR组和NC组给予相同体积的生理盐水。免疫组化法观察大鼠海马Aβ42的表达;免疫印迹法检测大鼠脑APP、β 分泌酶( BACE1)、γ 分泌酶（PS1）的变化。结果IR组和PIO组大鼠海马Aβ42的表达明显高于NC组,与IR组相比,PIO组表达明显减低（P<0.01）;与NC组相比,IR组和PIO组大鼠脑组织APP、BACE1及PS1的表达增高,PIO组表达较IR组减少(P<0.05)。 结论胰岛素抵抗大鼠脑组织通过上调BACE1、PS1活性,使Aβ42生成增加;吡格列酮能抑制BACE1、PS1的表达,减少Aβ42生成。     

药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀对阿尔茨海默病的治疗作用研究

目的：观察吲哚美辛与阿托伐他汀组合对阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）的治疗作用。方法：在口服给予APP/PS1 转基因小鼠药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀90 d 后进行Morris水迷宫和穿梭箱实验,并应用免疫荧光染色技术,观察小鼠脑中的Aβ沉积;应用AlphaLISA 技术检测小鼠中枢以及外周血中的Aβ含量;应用液相蛋白芯片技术和流式细胞术,检测小鼠外周血中细胞因子和脾细胞上清液中淋巴细胞亚型;应用放射免疫和化学发光技术,检测小鼠下丘脑- 垂体- 肾上腺轴（hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）和下丘脑- 垂体- 性腺轴（hypothalamicpituitary-gonadal,HPG）中的相关激素水平。结果：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够显著改善APP/PS1 转基因小鼠的空间学习记忆能力和主动回避反应能力,降低海马中的Aβ沉积以及Aβ1–42 水平,显著抑制外周血中促炎因子IL-1β、IL-23、GM-CSF、TNF-α、NF-β和eotaxin 的分泌,并促进抑炎因子IL-4 和G-CSF 的分泌。同时,药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀能够增加CD4+,CD28+ T 细胞的数量,降低CD4+,CD25+,Foxp3+ T 细胞的数量,显著降低HPA 轴中ACTH、HPG 轴中GnRH 和LH 的水平。结论：药物组合吲哚美辛与阿托伐他汀合用能够改善APP/PS1 转基因小鼠紊乱的免疫系统,调节神经内分泌系统的失衡,进而改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆能力和病理损伤,提示吲哚美辛与阿托伐他汀的组合有可能成为防治AD 的潜在药物。     

异氟醚对缺锌APP/PS1转基因阿尔茨海默病模型小鼠海马神经元凋亡的影响

目的：研究吸入麻醉药异氟醚对缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡的影响,探讨其相关作用机制。方法：8和9月龄APP/PS1转基因小鼠随机分为常锌组、常锌+异氟醚组、缺锌组和缺锌+异氟醚组,每组24只。常锌组小鼠给予正常锌含量饮食2个月;常锌+异氟醚组小鼠给予正常锌含量饮食2个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h;缺锌组小鼠给予低锌饮食1个月;缺锌+异氟醚组小鼠给予低锌饮食1个月后接受1.4%异氟醚麻醉2 h。分别在麻醉后6和24 h杀鼠取海马组织,采用免疫荧光双染法检测海马神经元凋亡率,Western blotting法检测海马β淀粉样蛋白（Aβ）、活化型半胱氨酸天门冬氨酸特异性蛋白酶3（Cleaved caspase-3）表达水平和Bax/Bcl-2比值。结果：与常锌组比较,常锌+异氟醚组小鼠麻醉后6 h海马神经元凋亡率、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）,麻醉后24 h海马神经元凋亡率总Aβ、Aβ40和Aβ42表达水平无明显改变（P>0.05）;缺锌组和缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42表达水平、Cleaved caspase-3表达水平和Bax/Bcl-2比值升高（P<0.05或P<0.01）。与缺锌组比较,缺锌+异氟醚组小鼠麻醉后6和24 h海马神经元凋亡率、Aβ42和Cleaved caspase-3表达水平及Bax/Bcl-2比值进一步升高（P<0.05或P<0.01）。结论：10月龄常锌APP/PS1转基因小鼠给予1.4%异氟醚麻醉2 h能够短暂加重其海马神经元凋亡;1.4%异氟醚麻醉2 h能够明显加重缺锌APP/PS1转基因小鼠海马神经元凋亡,其作用机制可能与促进海马Aβ42聚集、增强Bax表达、抑制Bcl-2表达和激活Caspase-3有关。     

脑胰岛素信号在阿尔兹海默症模型小鼠渐进过程中的改变

目的：探讨阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）形成过程中脑胰岛素信号及葡萄糖转运体（glucose transporters,GLUTs）表达的改变,为AD早期诊断提供依据。方法：借助APP/PS1转基因AD模型小鼠,运用Western blot检测该模型鼠皮层和海马区域胰岛素信号通路相关蛋白的表达。结果：与对照组相比,AD模型鼠在3月龄时,表现为脑胰岛素信号应激性激活,下游AKT/GSK3β等胰岛素信号分子磷酸化水平升高,而GLUTs此时表达变化不明显;5月龄时,该模型表现为脑胰岛素信号磷酸化水平显著下降,其下游AKT/GSK3β等信号分子磷酸化水平表达下调,同时观察到海马中GLUT3、GLUT4表达下调,AD病理性蛋白（APP）、Tau蛋白磷酸化水平显著增加。结论：胰岛素信号紊乱和葡萄糖转运体在AD形成过程中发生紊乱,且随年龄增长,具有紊乱加剧的趋势。     

Dkk3 过表达改善阿尔茨海默症小鼠的老年斑、认知障碍和脑部糖代谢

目的：Dkk3 是WNT 信号通路的调节蛋白,主要在小鼠和人的心脏及脑组织中表达。前期研究发现,Dkk3 在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）小鼠模型及AD 病人脑组织中表达显著降低。而以往研究报道,在AD 疾病条件下,WNT 信号通路中某些关键成分会下调,并与AD发生发展相关。然而,Dkk3 如何作用于WNT 信号,以及Dkk3 对于AD 的调节作用和分子机制尚不清楚。因此本研究拟利用已经建立的脑组织特异的Dkk3 转基因小鼠和APPswe/PSΔE9 双转基因AD 模型小鼠,探究Dkk3 对AD 的调节作用及其分子机制。方法：RT-PCR 法克隆小鼠Dkk3基因cDNA,将该基因插入PDGF 启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立Dkk3转基因小鼠。PCR 法鉴定转基因小鼠的基因型,Western blot 检测Dkk3 蛋白表达水平,确定Dkk3高表达首建鼠。Western blot 和免疫荧光方法观察Dkk3 于AD 小鼠脑组织中的表达;开放旷场和Morris 水迷宫检测小鼠自主行为和认知功能改变;硫磺素荧光染色和Aβ抗体免疫荧光染色观察小鼠脑组织老年斑病理变化,Western blot 检测Aβ单体、二聚体表达水平;PET/CT 检测小鼠脑部糖摄取的改变;Glut1 抗体免疫荧光染色观察小鼠脑组织葡萄糖转运蛋白水平改变;Western blot 检测Dkk3 蛋白表达水平、tau 过度磷酸化、WNT 的信号通路关键分子的改变。结果：建立了脑组织特异表达的Dkk3 转基因小鼠品系,同时通过杂交获得了Dkk3×APPswe/PSΔE9 小鼠。免疫荧光显示Dkk3 在小鼠脑皮质、海马等脑区神经元中表达,星形胶质细胞中不表达。Dkk3 在AD 小鼠和AD 病人脑组织中均表达下调;Dkk3 转基因表达改善AD 小鼠的探究行为异常和认知功能缺陷;Dkk3 转基因表达可导致AD 小鼠脑内Aβ产量下降,老年斑大小、数量和沉积面积减少;Dkk3转基因表达增强AD 小鼠脑部糖摄取,增加葡萄糖转运蛋白Glut1 的表达;Dkk3 转基因表达抑制GSK-3β活性、增加PKCβ1 磷酸化水平。AD 病人脑组织中也可见GSK-3β活性增强、PKCβ1 磷酸化水平下降。结论：Dkk3 是一个WNT 通路的激动剂,DKK3 转基因表达补偿了AD 小鼠脑组织中的Dkk3 表达下调,逆转了WNT 信号下调,一定程度上延缓了AD 的病理发展进程,改善了认知功能,提示Dkk3 可成为AD 治疗的一个潜在新靶点。     

脂肪因子参与阿尔茨海默病的研究进展

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）又称老年痴呆,是一种最常见的老年中枢神经退行性疾病。其主要病理改变有：神经元外β- 淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）沉积形成的老年斑、神经元内tau 蛋白异常磷酸化形成的神经原纤维缠结以及神经元大量丢失或损伤。近年研究发现,脂肪因子与Aβ沉积、tau 蛋白过度磷酸化以及神经元凋亡之间具有紧密的联系。该文主要针对脂联素（adiponectin,APN）、瘦素（leptin,LP）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）等脂肪因子对AD 的作用机制做一综述,为AD 的临床治疗提供新的思路。     

记忆相关基因KIBRA 抑制Aβ 诱导的神经元凋亡研究

目的：为了明确记忆相关基因KIBRA 在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）转基因动物模型中是否存在表达改变及及其对神经元凋亡的影响,进而探讨KIBRA 如何参与Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制。方法：本研究首先通过免疫组织染色及免疫蛋白印迹的方法,观察在不同月龄APP/PS1 小鼠中是否存在KIBRA 的表达改变。其次,通过TUNEL 免疫荧光染色,观察在KIBRA 基因敲除小鼠中是否存在神经元凋亡。最后,我们使用CRISPR/CAS9 慢病毒及过表达慢病毒分别转染HT22 细胞,建立KIBRA 基因敲除和KIBRA 过表达细胞模型,进而探讨KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡及其相关机制的研究。结果：①KIBRA 在APP/PS1 转基因小鼠脑内特异性表达：选用9 月龄及12 月龄APP/PS1 小鼠作为AD 研究模型,通过KIBRA 免疫组织染色分析,无论整个海马,还是海马亚区CA1 区和CA3 区,9 月龄和12 月龄APP/PS1 小鼠KIBRA 阳性细胞数量均明显低于对照组,其中12 月龄尤为显著（P<0.01,P<0.001）。免疫蛋白印迹结果同样证实12 月龄APP/PS1 小鼠海马区KIBRA 的表达明显低于野生型小鼠（P<0.001）。随着月龄的增加,KIBRA在APP/PS1 转基因小鼠海马区的表达逐渐减少,提示KIBRA 在AD 小鼠海马区的特异性降低,与学习记忆障碍密切相关。②KIBRA 在神经元凋亡中的重要作用：通过TUNEL 荧光染色发现,与野生型小鼠相比,12 月龄APP/PS1 小鼠海马神经元凋亡比例明显增多（P<0.01,P<0.01）。4 月龄KIBRA 基因敲除小鼠海马神经元凋亡比例比野生型小鼠明显增加（P<0.05）,提示KIBRA 在神经元凋亡的发生中扮演不可或缺的角色。③KIBRA 对Aβ诱导的神经元凋亡的保护作用：CCK8及免疫蛋白印迹结果显示,与空病毒组相比,经1 μmol·L-1 的Aβ1-42 寡聚体处理后的KIBRA 敲除组细胞活力明显降低（P<0.01）;凋亡相关蛋白（剪切的PARP、活化的caspase3）的表达量明显增高（P<0.05,P<0.01）。KIBRA 过表达组细胞存活率明显优于空病毒组（P<0.05）,凋亡相关蛋白较空病毒组显著减少（P<0.05）,进一步提示KIBRA 参与抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖和存活。4. KIBRA 通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡：本实验筛选凋亡相关信号通路,结果显示,在1 μmol·L-1 Aβ1-42 寡聚体处理1 min 后,KIBRA 敲除组Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著降低（P<0.05）。在Aβ1-42 寡聚体处理1 分钟后,KIBRA 过表达组Akt Ser473 位点磷酸化明显被激活,Akt Ser473 位点磷酸化水平比空病毒组显著增高（P<0.01）。此外,与Aβ1-42 寡聚体干预组相比,Akt 特异性抑制剂（MK2206）预处理组KIBRA 过表达细胞存活率明显降低（P<0.05）;剪切的PARP 表达量明显增高（P<0.05）。以上结果表明KIBRA 通过激活Akt Ser473 位点的磷酸化水平,抑制Aβ诱导的神经元凋亡。结论：KIBRA 作为一种神经保护因子,通过激活Akt 信号通路抑制Aβ诱导的神经元凋亡,促进细胞增殖及存活,为AD 发病机制及治疗药物的研究提供了新的靶点。     

成年海马神经再生与阿尔茨海默病关系的研究进展

海马神经再生持续于哺乳动物整个成年期。在生理刺激以及脑外伤等病理因素的刺激下,神经干细胞可发生增殖、迁移、分化,最终整合到神经元网络中。阿尔茨海默病（Alzheimer^,s disease,AD）是一种中枢神经系统退行性疾病,主要病理学特征为细胞内外β淀粉样蛋白（β-amyloid peptide, Aβ）沉积、细胞内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFT）,以及由这些引发的神经元变性、坏死。目前,应用海马神经再生治疗AD已成为极具潜力的治疗手段。该文综述了最近成年海马神经再生与AD关系的研究进展。     

唐氏综合征细胞黏附分子在APP转基因小鼠海马中的表达变化及其意义

目的  观察唐氏综合征细胞黏附分子（DSCAM）在淀粉样前蛋白（APP）转基因小鼠海马中的表达变化规律,探讨其意义。方法  选择月龄分别为1、3、6和12个月的APP转基因和野生型小鼠,应用免疫组织化学法对脑切片进行染色,观察DSCAM在APP转基因小鼠脑中的表达,应用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测该蛋白在海马中表达量的变化规律,野生型小鼠做对照。结果  DSCAM主要在APP转基因小鼠大脑皮层、海马的锥体细胞中表达。在两组小鼠中,DSCAM在海马中的表达水平随年龄增长而下降（P <0.05）。DSCAM在APP转基因小鼠海马中的表达量明显高于同龄野生型小鼠（P <0.05）。结论  DSCAM在APP转基因小鼠海马内的过度表达可能在APP小鼠的学习和记忆能力下降中扮演重要角色。

     

金钗石斛生物碱抗老年痴呆基础研究

研究目的：探究金钗石斛生物碱（Dendrobium nobil Lindl Alkaloids,DNLA）抗老年痴呆作用及作用机制。方法：采用右侧脑室注射脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）或Aβ25-35 制备大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠动物模型,以及Aβ25-35 或氧糖剥夺诱导的大鼠原代神经元损伤细胞模型,通过行为学、组织形态学、免疫荧光、PCR、Western blot等技术手段,围绕学习记忆改变、炎症、tau 蛋白磷酸化、Aβ清除、自噬等评价DNLA 的抗老年痴呆作用及作用机制。结果：在LPS 诱导的大鼠学习记忆减退模型,预防性给予DNLA（20,40,80 mg·kg-1）,大鼠逃避潜伏期和搜索距离缩短,神经元坏死凋亡显著改善,其机制可能与降低海马caspase3/8 mRNA 表达、减少Aβ1 -42 产生、减轻海马Tau 蛋白磷酸化有关,值得注意的是DNLA
（80 mg·kg-1）的作用与甾体类抗炎药布洛芬相似,提示DNLA 的改善记忆作用与抗炎作用有关,后续研究发现DNLA 可抑制p-p38 MAPK 和NF-κB 通路降低炎症因子TNF-α及其受体TNFR1 的表达。在Aβ25-35 诱导的大鼠痴呆模型,给予DNLA 后可改善大鼠空间学习成绩,明显减少海马组织Aβ1-42 的含量,降低β- 淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）和BACE1 蛋白在海马组织的表达,另外,DNLA 可预防Aβ25-35 诱导的小鼠海马神经元及其突触缺失,该效应至少与增加其海马与皮质脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子及睫状神经营养因子等有关。在APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠,DNLA 可通过诱导神经元自噬改善模式小鼠空间学习记忆能力。离体细胞实验发现DNLA 抑制氧糖剥夺诱导的大鼠神经元细胞活力降低,减轻细胞凋亡,降低细胞膜通透性,改Aβ25-35 诱导的神经元轴突变性,作用机制与降低［Ca2+］i、增高MMP水平、下调caspase-3/12 基因表达、诱导自噬有关。结论：DNLA 可改善LPS 或Aβ25-35 诱导的大鼠学习记忆功能减退模型、APP/PS1 转基因阿尔茨海默病模式小鼠的学习记忆功能,作用机制与抗炎、抗凋亡、诱导自噬,减少Aβ沉积和tau 蛋白磷酸化等有关。     

二苯乙烯苷（泰思胶囊）治疗阿尔茨海默病的研究

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种多因素相关的复杂性疾病。近年来研发的一些AD 治疗药物在临床试验中不成功,重要原因之一是药物仅针对单靶点或单致病途径,不易取得好的疗效。因此目前国际上许多学者提出,应当应用多靶点、多途径的治疗策略来研发治疗AD 的药物。二苯乙烯苷（泰思胶囊）是我室自行研制的治疗AD 的中药创新药物。在临床前药效学研究中,二苯乙烯苷灌胃给药在8 种拟老年痴呆动物模型（包括APP/PS1 转基因AD 小鼠、Aβ侧脑室注射AD 小鼠、IBO 基底前脑注射致胆碱能损伤致痴呆大鼠、线粒体复合体Ⅳ抑制剂叠氮钠致痴呆大鼠、自然衰老大鼠及小鼠、D- 半乳糖致痴呆小鼠、慢性脑缺血致痴呆大鼠、高胆固醇血症致痴呆大鼠）能够明显改善学习记忆功能,减少脑内淀粉样斑块和Aβ 含量,减低β- 分泌酶和早老素-1 表达,抑制α-synuclein 过表达和聚集,上调泛素- 蛋白酶体系统,抑制tau 蛋白过度磷酸化,保护细胞骨架结构,增高胆碱乙酰基转移酶/ 乙酰胆碱酯酶的比值,抗神经炎症,抗氧化应激,增高线粒体活性和ATP 含量,增高神经营养因子神经生长因子（nerve growth factor,NGF）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）及其受体表达,保护神经突触的结构和功能,减少神经元死亡。其突出特点和优势是作用在AD 发病机制的多靶点多途径,尤其具有神经保护和神经营养作用,可阻止及延缓神经元死亡。二苯乙烯苷（泰思胶囊）获得发明专利授权3 项,获CFDA 新药临床研究批件,已完成治疗轻中度AD 的随机、双盲、安慰剂对照、阳性药（多奈哌齐）对照、多中心2 期临床试验,显示良好的有效性和安全性,目前已进入治疗AD 的3 期临床试验。     

复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的研究

目的：探讨复方丹参片对老年痴呆症合并焦虑障碍的作用及机制。方法：4 月龄野生型小鼠和APP/PS1 转基因小鼠分别灌胃给予溶剂或复方丹参片60 天后,采用Morris 水迷宫实验、新物体识别实验、新奇抑制摄食实验和高架十字迷宫实验评价复方丹参片对APP/PS1 转基因小鼠学习记忆功能和焦虑样行为的影响;应用ELISA 检测小鼠海马淀粉样蛋白Aβ40、Aβ42、γ- 氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）和脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）的含量;Real time PCR 和Western Blot 分别检测IDE/NEP 的mRNA 和蛋白水平变化。结果：复方丹参片720 mg·kg-1 明显短缩小鼠在水迷宫实验中找到平台的潜伏期,360 mg·kg-1 和720 mg·kg-1 明显增加小鼠原有平台象限的探索时间;复方丹参片720 mg·kg-1 可显著性增加APP/PS1 转基因小鼠对新物体的识别指数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性增加APP/PS1 转基因小鼠在高架十字迷宫中开臂的时间百分比和进入开臂的次数;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性缩短APP/PS1 转基因小鼠摄食潜伏期;复方丹参片360 mg·kg-1、720 mg·kg-1 显著性降低APP/PS1 转基因小鼠海马Aβ40、Aβ42 的浓度和增加GABA 和BDNF 含量;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性上调APP/PS1 转基因小鼠海马IDE、NEP mRNA 的表达;复方丹参片720 mg·kg-1 显著性增加小鼠海马IDE 蛋白表达。结论：复方丹参片改善APP/PS1 转基因小鼠的学习记忆损伤和焦虑样行为,可能与增加脑组织GABA 和BDNF 含量、IDE 的蛋白表达及降低Aβ40、Aβ42 水平有关。