心脏死亡供体原位肝移植术后胆道并发症的原因探讨和诊疗经验

目的: 探讨心脏死亡供体（donation after cardiac death,DCD）原位肝移植术后胆道并发症的发生因素、诊断要点和治疗方法。方法: 对2015年1月—2016年8月于南京医科大学第一附属医院肝移植中心实施的87例DCD供肝肝移植患者临床资料进行回顾性分析。87例中29例行经典原位肝移植,58例行改良背驮式肝移植,胆管重建方式均为胆总管端端吻合,无1例放置T管。结果: 87例肝移植患者中9例通过胆道造影确诊为肝移植术后胆道并发症, 8例治愈, 1例好转, 无死亡。胆道并发症发生率10.1%(9/87)。结论: DCD供体原位肝移植术后胆道并发症的发生与供肝缺血时间、DCD供肝质量、胆管吻合技术及供肝修剪技术等因素有关,术后胆道造影有助于及时诊断胆道并发症。介入技术是胆道并发症的主要治疗手段。     

活体肝移植的胆道重建

目的探讨活体肝移植（LDLT）中胆道重建技术及并发症处理原则,减少胆道并发症的发生．方法回顾性分析活体肝移植18例,其中右半肝11例,左半肝10例,双供体（右半肝＋左半肝）3例,胆道重建采用显微外科技术．17例行胆管-胆管端端吻合,1例行肝管空肠吻合．结果术后3例受体发生了胆道并发症．2例为成人右半肝移植,1例于术后2d发现胆漏,经保守治疗无效,再次开腹改行肝管空肠吻合后治愈;1例术后3月发现胆管轻度狭窄,行保守治疗治愈．1例为双供体置入T管者,术后第3天发现胆漏,行保守治疗后治愈．结论在活体肝移植中采用显微外科技术,适当整形胆管行胆管-胆管端端吻合,有助于降低术后胆道并发症的发生．     

肝移植术后胆道并发症发生原因及预防

目的：探讨同种异体原位肝移植术后胆道并发症发生的原因及预防措施．方法：回顾性分析我院1999年6月至2005年2月完成的50例同种异体原位肝移植．经典式肝移植4例，改良背驮式肝移植45例，其中包括2例肝肾联合移植，部分亲体肝移植1例．50例中经门静脉、下腔静脉转流下原位肝移植22例，无转流28例．胆道重建：胆管对端吻合49例，其中28例置“T”管外引流，21例未置“T”管引流．胆肠吻合1例．结果：共有7例发生胆系并发症，2例为术后近期经腹腔引流管少量胆漏，1周左右停止．2例为术后远期(1～3月)因发热再次入院经影像学证实为胆管吻合漏，肝门区包裹性积液形成．3例手术后1～3月内发生肝内胆管狭窄并淤泥形成．结论：供体胆道即时充分的灌洗，移植物冷热缺血的时间不宜过长及良好的胆道吻合技术和确保胆道血供，是预防肝移植术后胆道并发症的关键．     

活体肝移植的几点关键外科技术

目的:探讨活体肝移植的几点关键外科技术。方法:2001年1月至2002年3月底,实施活体肝移植11例,其中左半肝8例,左外叶1例,成人右半肝2例;根据术前CT、血管造影和术中B超确定肝切除线,超声电刀离断肝实质,经门静脉灌注原位获取。受体手术采用保留腔静脉的全肝切除。移植肝原位植入.肝静脉重建采用扩大成型吻合技术,显微技术吻合肝动脉,胆道重建采用端端吻合,置“T”管引流。结果:11例供体术后顺利康复出院,未发生严重并发症。11例受体中,1例发生肝动脉血栓形成需再次肝移植,1例因不可逆转的严重排斥反应,于术后72 d死亡。10例受体康复出院,肝功能、铜氧化酶恢复正常。结论:活体肝移植对供体是相对安全的。管道重建技术是活体肝移植的重要环节。术前、术中了解供体的解剖变异并正确处理,可降低并发症发生率。     

肝移植治疗内脏全反位肝癌患者1例及并发症处理

目的:应用原位肝移植治疗1例内脏全反位肝癌患者,并探讨术后并发症的处理方法.方法:将正常解剖的供肝绕中线顺时针垂直旋转90°植入患者原位,所有管道吻合口均采取端-端吻合的方法,患者术后随访并积极处理并发症.结果:患者术后恢复良好,5个月出现胆管吻合口狭窄.经内镜下逆行胆管内支架引流(ERBD)和经皮肝穿刺胆管引流(PTCD)治疗后痊愈.随访30个月,移植肝功能正常.肿瘤无复发.结论:内脏全反位肝癌患者可实施原位肝移植治疗,胆道并发症是其主要并发症之一,经过及时处理可获得良好的长期预后.     

临床活体肝移植4例报告

目的:总结原位活体肝移植的临床资料,探讨活体肝移植的关键手术技术.方法:对北京大学人民医院2003年2月至2006年11月实施的4例原位活体肝移植的临床资料进行回顾性分析.结果: 4例均为成人活体供肝,其中右半肝3例(不包含肝中静脉的2例,包含肝中静脉的1例),扩大左外叶(不包含肝中静脉)1例,移植物重量/受体体重0.85%～1.44%.其中3例供、受体行肝右静脉端端吻合,1例供肝肝左静脉与受体成形后的肝左、肝中静脉吻合.2例供肝肝右动脉与受体肝固有动脉端端吻合,1例供肝肝右动脉分支经受体桡动脉搭桥后与受体肝固有动脉端端吻合,1例供肝肝左动脉与受体肝固有动脉端端吻合.4例供肝胆管成形后与受体的肝总管端端吻合,其中2例留置"T"型管引流.4名供者术后均顺利康复,未出现严重并发症;4例受者手术顺利,术后无血管并发症,1例未留置"T"管的儿童受者胆管吻合口轻度狭窄.受体现已分别健康存活58个月、32个月、20个月及14个月.结论:原位活体肝移植手术过程复杂,技术要求高,选择好合适的供体、灵活掌握关键的手术技术可以使活体肝移植患者获得良好的预后.     

原位肝移植术中肝动脉重建临床研究

目的 探讨原位肝移植术中肝动脉重建方式。方法 回顾性分析1999－02－2001－02完成的22例原位肝移植术中肝动脉整形、重建过程。直视下以7／0或9／0Prolene缝线完成供肝动脉血管整形及供、受体肝动脉吻合。术后1周内静脉给予低分子右旋糖杆10ml/h，以多普勒超声扫描监测肝动脉血流。结果 1例术后5d时肝动脉血栓形成，介入溶栓后吻合口出血，再次手术吻合。1例术后1月肝外胆管狭窄，支架内支撑后治愈。21例无肝动脉并发症发生。15例随访1－20月（平均8．6月），多普勒超声扫描提示肝动脉形态、血流量正常，胆道造影未见肝外胆管狭窄，血清学检查提示肝功能状态良好。结论 供肝动脉变异时宜采取适宜的方式整形重建肝动脉以利血管吻合。动脉吻合时操作清细，实现血管内膜对内膜的对端吻合。     

大鼠原位肝移植模型建立方法的若干问题探讨

目的探讨建立大鼠原位肝移植模型的方法与技术。方法用改进的二袖套法行100例Lewis→BN大鼠原位肝移植,术中门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合,肝上下腔静脉用缝合法吻合,胆管内支架法完成胆道重建。结果供体手术时间(30.9±5.0)min,供肝修整时间(10.0±3.0)min,受体手术时间(50.0±5.5)min,无肝期为(23.0±2.5)min。手术成功率为92%(术后存活2 d以上),1周存活率为87%,1个月存活率为84%。结论通过提高手术技巧,熟悉各种并发症的原因和预防处理措施,可以减少并发症的发生,提高手术成功率,延长大鼠术后存活时间。     

肝移植术后胆道并发症的防治

为探讨肝移植术后胆道并发症的防治，分析6例终末期肝病(包括1例小肝癌)患者行原位肝移植患者的临床资料，供肝均经动脉及门静脉双重灌注，胆道重建采用胆管端端吻合。结果，6例中2例出现胆道并发症：1例于术后6日出现胆漏，经调整右肝下引流管的位置，术后第31天胆漏停止，另1例于术后5周出现胆汁减少、胆栓形成，经胆道冲洗、口服溶石药及抗感染等治疗，胆汁引流恢复。认为对供者动脉充分灌注，胆道充分冲洗，尽量减少对供者胆管血供的损害，视情况放置T管是预防胆道并发症的关键，而术后胆道并发症多经非手术治愈。     

内镜下逆行胰胆管造影对肝移植术后胆道并发症的诊疗作用（附12例报告）

目的评价内镜下逆行胰胆管造影(ERCP)对肝移植术后胆道并发症的诊断和治疗价值。方法应用电子十二指肠镜对原位肝移植术后疑有胆道并发症(梗阻性黄疸)的12例患者进行ERCP。结果显示胆总管狭窄(梗阻)9例(伴胆总管结石2例)，胆总管结石2例(伴胆总管扩张1例)，移植肝肝内胆管变细1例。内镜下作胆总管气囊扩张、取石、放置金属胆总管内支架1例．Oddi括约肌切开取石3例。留置鼻胆管引流2例。结论ERCP可作为原位肝移植术后胆道并发症诊断和治疗的主要手段．而且对大多数肝移植术后病人是安全有效的。     

转录因子GATA结合蛋白3对哮喘易感基因ADAM33表达的影响

目的:探讨转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对解整合素金属蛋白酶33(a disintegrin and metalloproteinase 33,ADAM33)基因启动子活性及mRNA表达的影响.方法:以人正常肺上皮BEAS-2B细胞DNA为模板经PCR扩增得到AD...     

p53RFP 表达载体的构建及其对HEK293A细胞增殖的抑制作用

  目的 构建p53RFP 表达载体,观察p53RFP 表达上调对HEK293A细胞生长的影响。方法 利用DNA克隆技术,将人p53RFP基因的编码序列克隆至质粒pcDNA 4/Myc-HisA,经限制性酶切、DNA测序鉴定重组载体。质粒扩增提取,经脂质体介导法转染HEK293A细胞,实时定量RT-PCR、Western blot检测转染后p53RFP mRNA及蛋白的表达水平。采用CCK-8检测p53RFP 表达上调对HEK293A细胞增殖的影响。结果 p53RFP转染后其mRNA及蛋白表达水平均显著上调;p53RFP转染后72 h、96 h细胞增殖受到显著抑制（P<0.01)。结论 成功构建p53RFP表达载体pcDNA 4/-p53RFP,并可在HEK293A细胞有效表达,其表达可抑制HEK293A细胞增殖。     

组蛋白乙酰化激活人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子转录的机制研究

  目的  研究组蛋白乙酰化对人脑胶质瘤中胶质细胞源性神经营养因子基因(GDNF)的表达调控和具体机制。  方法  取正常人脑组织、低级别胶质瘤脑组织(LG-glioma)、高级别胶质瘤脑组织(HG-glioma)各6例。用组蛋白乙酰化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制处理人脑神经胶质瘤U251细胞。实时荧光定量PCR检测脑组织及细胞中的GDNF mRNA水平,染色质免疫共沉淀(ChIP)-PCR检测GDNF启动子区转录因子cAMP应答元件结合蛋白(CREB)结合位点的H3K9乙酰化水平,以及转录因子CREB与GDNF启动子区的结合能力,同时检测组蛋白乙酰化酶和脱乙酰化酶抑制剂对转录因子CREB结合能力和GDNF表达的影响。  结果  与正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织比较,高级别胶质瘤组织的GDNF mRNA水平高(P < 0.01),GDNF启动子区的H3K9乙酰化水平增加(P < 0.01),且GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平高于非CREB结合区的乙酰化水平(P < 0.01)。高级别胶质瘤组织中CREB与GDNF启动子区的结合能力高于正常脑组织和低级别脑胶质瘤组织(P < 0.05)。组蛋白乙酰化酶抑制剂处理U251细胞后,GDNF启动子上CREB结合区的乙酰化水平下降,CREB与GDNF启动子结合活性下调,并下调GDNF mRNA和蛋白水平,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有相反作用(P < 0.01)。  结论  组蛋白乙酰化通过促进转录因子CREB与GDNF基因启动子区的结合,从而促进胶质瘤中GDNF的高转录。     

大鼠Caspase 8基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠Caspase 8基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK293)中,过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对Caspase 8基因启动活性的影响?同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠Caspase 8基因启动子序列(-1136~+101 nt),将Caspase 8基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将Caspase 8基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-Caspase 8-FL)和大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对Caspase 8基因的启动作用?另用生物信息学软件预测Caspase 8基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建Caspase 8基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-Caspase 8-1~4)?将上述Caspase 8基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-Caspase 8-FL和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,Caspase 8基因启动子活性显著增加?而将pGL3-Caspase 8-FL?pGL3-Caspase 8-1~4和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-Caspase 8-4的启动活性显著低于pGL3-Caspase 8-2和pGL3-Caspase 8-3?提示IRF-1可能结合在Caspase 8基因启动子的-336~-136 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠Caspase 8基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在Caspase 8基因启动子上的结合区域?     

大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

宫颈癌细胞PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统的构建

目的:建立PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统。方法:首先,通过甲基化特异性PCR（MSP）测定宫颈癌细胞系（CaSki,SiHa）及正常细胞（人胚肾细胞HEK293T）中 PAX1基因启动子的DNA甲基化水平;通过荧光定量PCR（RT-PCR）和免疫印迹（Western blotting）分别检测上述细胞系的mRNA及蛋白表达。然后,在PAX1高甲基化的宫颈癌细胞共转染sgRNA（single guide RNA）和dCas9-Tet1质粒,采用焦磷酸测序（Pyrosequencing）和 RT-PCR分别检测其基因甲基化和表达水平的改变。最后,结合生物信息学预测和RT-PCR评估该CRISPR系统的脱靶效应。结果:与HEK293T细胞相比,宫颈癌细胞的PAX1基因启动子呈现高甲基化,且其mRNA（CaSki:t=9.13;SiHa:t=12.31;P<0.05）和蛋白表达水平（CaSki:t=16.72;SiHa:t=11.81;P<0.05）均降低。在CaSki及SiHa细胞系中,去甲基化sgRNA3（act-sgRNA3）组调控最显著,其PAX1基因的甲基化水平在CaSki和SiHa细胞系中分别下降了22.21%（t=6.65,P<0.05）、19.62%（t=17.00,P<0.05）,其mRNA表达水平均显著上调（P<0.05）。且该系统脱靶效应基因的表达差异均小于2倍。结论:本研究成功建立了PAX1基因甲基化的CRISPR靶向调控系统,可有效的降低其甲基化水平,增强其内源性的表达水平。     

CENP-I表达下调对HEK293细胞生长及染色体分离的影响

目的 构建CENP-Ⅰ特异性RNA干扰真核表达载体,体外观察抑制CENP-Ⅰ基因表达对HEK293细胞生长、细胞周期和染色体数目异常率的影响.方法 构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,脂质体法将pGenesil-1空载体和pGene-sil-1/CENP-I-siRNA-1、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-2、pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3真核表达载体分别导入人胚肾HEK293细胞.转染后24、48、72 h收集细胞用Western blot和FQ-PCR检测HEK293细胞内CENP-Ⅰ蛋白及mRNA水平的表达情况,以确定干扰效果及最佳干扰时间.MTT法检测各实验组细胞生长情况,流式细胞术检测各组细胞的细胞周期分布,Giemsa染色法计数细胞分裂指数,常规法制备染色体标本.结果 成功构建CENP-Ⅰ siRNA真核表达载体,筛选出具有干扰效果的质粒载体即pGenesil-1/CENP-Ⅰ-siRNA-3,转染人胚肾HEK293细胞72 h后可使CENP-Ⅰ蛋白及mRNA表达显著下调.CENP-Ⅰ表达降低的HEK293细胞生长速度明显减慢(P<0.05),G2/M期细胞增加,分裂期细胞比例增大.结论 RNA干扰有效地特异性抑制着丝粒特异性蛋白质CENP-Ⅰ的表达.CENP-Ⅰ的抑制可使人胚肾HEK293细胞生长减慢,增殖能力减弱,使细胞分裂期延长.     

逆转录病毒载体介导shRNA对人胚胎肾细胞中p53基因的沉默作用

目的：检测逆转录病毒载体介导的小发夹环RNA（small hairpin RNA,shRNA）对人胚胎肾细胞（HEK293）中p53基因的干扰作用。方法：将人H₁启动子由XholⅠ和EcoRⅠ酶切位点插入CMV启动子上游,人CD₄基因替代匀霉素抗性基因,作为检测标志。针对人野生型p53基因设计的shRNA被连接在H₁启动子的下游,构建含有shRNA的逆转录病毒载体LTRH₁-p53,即RNAi表达载体;利用流式细胞术检测逆转录病毒感染HEK293细胞72 h后细胞内P53蛋白水平的变化。结果：成功构建LTRH₁-p53载体,该载体感染HEK293细胞后72 h,与感染空病毒载体LTRH₁组相比,P53蛋白表达降至空病毒载体LTRH₁组的69％（P<0.01）。结论：LTRH₁-p53表达载体成功使p53基因沉默,shRNA表达载体的使用为基因功能研究提供有力工具。