肥大细胞类胰蛋白酶对人肾成纤维细胞增殖和I型胶原表达的影响

目的　探讨肥大细胞类胰蛋白酶在慢性肾组织纤维化中的作用。方法　应用MTT比色法检测类胰蛋白酶对成纤维细胞的增生,RT PCR检测I型胶原mRNA的表达。结果　肥大细胞类胰蛋白酶可促进肾间质成纤维细胞增生和I型胶原mRNA的表达,且依赖于肝素的存在。蛋白水解酶抑制剂苯甲脒能抑制类胰蛋白酶的上述效应。结论　肥大细胞类胰蛋白酶可直接作用于肾间质成纤维细胞,参与肾间质纤维化过程。     

诺新康对人皮肤瘢痕胶原基因表达的影响

目的 研究诺新康对人皮肤增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响.方法 用RT-PCR法检测诺新康对人皮肤增生性瘢痕Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达.结果 诺新康能明显抑制人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,并呈剂量依赖性.结论 诺新康可通过抑制人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达而起到抑制皮肤增生性瘢痕增殖的作用.     

TGF-β1对人肾成纤维细胞热休克蛋白47表达的影响

目的 探讨TGF-β1在肾组织纤维化中的作用机制.方法 采用原代培养的人肾成纤维细胞,将细胞分为0、0.1、1、5ng/ml和10ng/ml不同浓度TGF-β1刺激培养组.应用免疫细胞化学方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达,RT-PCR方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞HSP47和I型胶原mRNA表达.结果 (1)对照组(0ng/ml TGF-β1组)人肾成纤维细胞几乎无HSP47表达,在 TGF-β1刺激下,培养的人肾成纤维细胞HSP47表达增强.(2)在0.1～5ng/ml范围内,TGF-β1以剂量依赖方式促进培养的人肾间质成纤维细胞表达HSP47和I型胶原mRNA.结论 TGF-β1促进肾组织纤维化形成,可能部分是通过其促进肾间质成纤维细胞表达HSP47,进而增加胶原合成所致.     

类胰蛋白酶对HSCⅠ型胶原和PAR-2表达的影响

目的观察类胰蛋白酶对肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原和蛋白水解酶激活受体-2(PAR-2)表达的影响,探讨类胰蛋白酶在肝纤维化中的作用.方法用Percoll密度梯度离心法分离、培养大鼠HSC,经系列浓度类胰蛋白酶作用后,应用RT-PCR法检测Ⅰ型胶原和PAR-2mRNA 的表达.结果类胰蛋白酶(1~100ng/ ml)能够促进HSCⅠ型胶原及PAR-2mRNA的表达,此作用呈剂量依赖性(各实验组与对照组比较,P <0.05).结论类胰蛋白酶可能通过PAR-2作用于HSC,促进HSC表达Ⅰ型胶原,参与肝纤维化的发生发展过程.     

ALK7在高糖诱导的心肌成纤维细胞转化及Ⅰ型胶原合成中的作用

目的 研究高糖诱导的心肌间质纤维化(心肌成纤维细胞表型转化以及胶原分泌)过程中活化素受体样激酶7(ALK7)的作用。方法 体外高糖培养大鼠心肌成纤维细胞,免疫荧光法观察成纤维细胞表型转化, real time PCR法检测心肌成纤维细胞ALK7和Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平,ELISA法检测心肌成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原水平,Western blotting法测定心肌成纤维细胞ALK7蛋白的表达水平;siRNA抑制ALK7表达,再次观察高糖对心肌成纤维细胞表型转化及上述各因子表达的影响。结果 高糖刺激心肌成纤维细胞转化为肌成纤维细胞;高糖促进Ⅰ型胶原mRNA 和蛋白的表达(P＜0.05);高糖促进成纤维细胞ALK7 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05); ALK7 siRNA 抑制ALK7的表达后,高糖促进心肌成纤维细胞转化及合成Ⅰ型胶原的作用下降(P＜0.05)。结论 ALK7参与了高糖诱导的心肌成纤维细胞表型转化及合成Ⅰ型胶原的代谢过程。     

MiR-29c在大鼠肾间质成纤维细胞中的抗纤维化作用

目的:在细胞水平探索miR-29c在肾脏纤维化中的作用.方法:检测TGF-β,对大鼠肾间质成纤维细胞的促纤维化作用及该过程中miR-29c表达的变化.miRanda和高通量测序找出miR-29c的靶基因.通过转染miR-29c mimics(高表达),检测其对胶原Ⅰ(Col Ⅰ)表达的影响.结果:TGF-β1能刺激大鼠肾间质成纤维细胞转分化;大鼠肾间质成纤维细胞转分化后miR-29c表达下调;上调miR-29c能抑制TGF-β1的促转分化作用.结论:miR-29c mimics通过有效抑制TGF-β1刺激NRK-49F细胞株Col Ⅰ表达起到抗纤维化作用,人工合成的miR-29c mimics转染NRK-49F细胞株有效提高miR-29c表达量从而抑制Col Ⅰ表达,为治疗肾间质纤维化提供了一个新的靶点.     

黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响

目的 探讨黄芪对糖尿病足溃疡处成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA及Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响.方法 用含/未含黄芪的培养液培养糖尿病足溃疡处成纤维细胞,RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达,放免法检测培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量.结果 用含黄芪的培养液培养的糖尿病足溃疡处成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达及培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量高于未含黄芪的培养液培养的细胞,且差异有统计学意义(P＜0.05).结论 黄芪能上调糖尿病足溃疡处成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达和促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成.     

依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的防治作用

目的:动态观察血管紧张素转换酶抑制剂依那普利对单侧输尿管梗阻大鼠肾间质纤维化的影响.方法:采用单侧输尿管梗阻模型,雄性SD大鼠64只随机分为假手术组(n=16)、模型组(n=24)和依那普利治疗组(n=24).治疗组从造模前24 h开始以依那普利10 nag/(kg·d)灌胃,模型组和假手术组以等体积的生理盐水灌胃.分别于造模后第3,7,14,21天处死大鼠,取梗阻侧肾组织,行HE染色和Masson染色观察各组大鼠肾组织病理改变,采用real-time PCR方法检测肾组织Ⅰ型胶原mRNA的表达,应用Westem免疫印迹检测结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)蛋白表达.结果:随着梗阻时间的延长,模型组大鼠肾间质损伤指数评分逐渐增加,肾间质胶原相对面积逐渐增大,Ⅰ型胶原mRNA和CTGF蛋白表达逐渐增加.依那普利治疗后,肾间质损伤指数和肾间质胶原相对面积下降,Ⅰ型胶原mRNA和CTGF蛋白表达均减少,与模型组比较,差异在第3,7,14天有统计学意义(P<0.05),而在第21天无统计学意义(P>0.05).结论:依那普利可减轻梗阻肾间质纤维化,这一作用可能与其能抑制肾组织Ⅰ型胶原mRNA和CTGF蛋白表达有关.     

白血病抑制因子对肾间质成纤维细胞活化的影响

目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)对肾间质成纤维细胞活化的干预作用.方法 体外培养正常大鼠肾脏成纤维细胞,分对照组、转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)处理组及TGF-β1和LIF共处理组,电镜下观察细胞形态变化,通过RT-PCR及Western blot检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)表达的改变,双抗体夹心ABC-ELISA检测细胞上清Ⅰ型胶原.结果 TGF-β1引起成纤维细胞激活,产生形态学改变,α-SMA表达增高(P<0.01),Ⅰ型胶原产生增加(P<0.01).与TGF-β1处理组相比,LIF干预组形态学改变不明显,LIF能干预TGF-β1引起大鼠肾间质成纤维细胞α-SMA表达和Ⅰ型胶原产生.结论 LIF可以抑制TGF-β1引起的肾间质成纤维细胞激活.     

风心病中肥大细胞与心肌纤维化的关系

目的探讨风心病心肌中肥大细胞与心肌纤维化的关系. 方法用甲苯胺兰染色检测患者心肌组织中肥大细胞数量,用HE, Messon染色检测心肌纤维化面积,用免疫组化法检测PCNA, Ⅰ, Ⅲ型胶原表达量,并将结果进行相关性分析. 结果风心病心肌组织中心肌纤维化明显增加,且与PCNA表达量呈明显正相关(r=0.857, P<0.001). 肥大细胞数量在实验组较正常对照组明显增多,其数量与心肌组织中Ⅰ, Ⅲ型胶原表达量呈正相关(rⅠ=0.797, rⅢ=0.851, P<0.01). 结论风心病心肌组织中肥大细胞参与了胶原合成及代谢,检测肥大细胞数可间接反映胶原增生状态.     

低氧促进大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成

目的研究低氧(2%氧)对成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成、总蛋白合成及Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA表达的影响.方法分离培养成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞,采用液体闪烁计数方法检测心脏成纤维细胞胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率来观察细胞胶原蛋白合成变化,并检测3H-亮氨酸掺入率观察细胞总蛋白合成的变化,采用RT-PCR检测Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA的表达.结果成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞在低氧第24、48小时胶原酶敏感的3H-脯氨酸掺入率较常氧组显著增加,分别增加132%(P＜0.05)和163%(P＜0.01);低氧12 h起Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA表达显著高于常氧培养的细胞.结论低氧能够直接促进体外培养的成年Wistar大鼠心脏成纤维细胞胶原蛋白合成和Ⅰ、Ⅲ型胶原前α肽链mRNA的表达,提示低氧对心脏成纤维细胞胶原合成代谢的直接调节可能是低氧性心肌纤维化的重要机制.     

白黎芦醇对胶原合成及相关基因表达的影响

目的探讨白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及降解影响的机理.方法用MTT法检测及原位杂交技术,对增生性瘢痕用白黎芦醇作用不同时间后,成纤维细胞的增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的原位表达进行了研究.结果(1)白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞的抑制率随浓度的增加和作用时间的延长而增强,最大抑制率可达到93.69%.(2)Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA 3 d已被明显抑制(P＜0.01),7 d后表达强度进一步下降,白黎芦醇对Ⅰ型前胶原mRNA的抑制作用要比Ⅲ型前胶原强.结论(1)白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖有抑制作用,且呈剂量时间依赖性.(2)白黎芦醇对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA有明显抑制作用,对Ⅰ型前胶原mRNA的抑制作用要比Ⅲ型前胶原强.     

Echistatin对人增生性瘢痕成纤维细胞的作用研究

目的研究Echistatin对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。方法体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞,设Echistatin处理组和对照组,MTT法、流式技术及RT-PCR法检测人增生性瘢痕成纤维细胞增殖、凋亡及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果Echistatin可明显抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖,促进凋亡,降低Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结论Echistatin可作为防治增生性瘢痕的筛选药物。     

真皮与脂肪组织来源成纤维细胞致纤维化能力的比较研究

目的初步探讨真皮与脂肪组织来源的成纤维细胞的致纤维化能力及其作用机制。方法自同一杜洛克雌性猪真皮和皮下脂肪组织中分别分离和培养成纤维细胞,利用倒置显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态和超微结构,采用Real-TimePCR技术检测细胞Ⅰ型和Ⅲ型前胶原、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、转化生长因子β1（TGF-β1）和类胰岛素样生长因子1（IGF-1）mRNA的相对表达量。结果与脂肪来源的成纤维细胞比较,真皮组织来源的成纤维细胞胞体较大,粗面内质网扩张明显。Real-Time PCR检测结果显示：真皮组织来源的成纤维细胞中Ⅰ型前胶原和α-SMA的mRNA相对表达量均显著高于脂肪来源的成纤维细胞（P〈0.05）,而Ⅲ型前胶原和IGF-1的mRNA相对表达量显著低于脂肪来源的成纤维细胞（P〈0.05）;两种不同组织来源成纤维细胞中TGF-β1 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论真皮与脂肪组织来源的成纤维细胞在与致纤维化相关的细胞形态和功能方面均存在差异。在真皮和脂肪组织受到创伤后的纤维化进程中,两种组织来源的成纤维细胞致纤维化的起点已存在差异。     

白黎芦醇对胶原合成及相关基因表达的影响

目的探讨白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型胶原合成及降解影响的机理.方法用MTT法检测及原位杂交技术,对增生性瘢痕用白黎芦醇作用不同时间后,成纤维细胞的增殖及Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA的原位表达进行了研究.结果(1)白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞的抑制率随浓度的增加和作用时间的延长而增强,最大抑制率可达到93.69%.(2)Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA 3 d已被明显抑制(P＜0.01),7 d后表达强度进一步下降,白黎芦醇对Ⅰ型前胶原mRNA的抑制作用要比Ⅲ型前胶原强.结论(1)白黎芦醇对人皮肤瘢痕组织成纤维细胞增殖有抑制作用,且呈剂量时间依赖性.(2)白黎芦醇对Ⅰ、Ⅲ型前胶原mBNA有明显抑制作用,对Ⅰ型前胶原mRNA的抑制作用要比Ⅲ型前胶原强.     

丹参素和川芎嗪对血管紧张素Ⅱ致心肌间质成纤维细胞增殖相关基因的影响

目的通过研究活血药对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)致心肌间质成纤维细胞增殖相关基因的影响,从分子生物学角度探讨活血中药的有效组分丹参素和川芎嗪在AngⅡ诱导心肌肥大反应中的作用机制。方法以胶原Ⅰ和胶原Ⅲ基因表达为心肌间质指标,采用一步法,应用TRIZOL Reagent提取总RNA,然后用RT-PCR方法测定胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的mRNA表达。结果AngⅡ可显著增加胶原ⅠmRNA的表达(P<0.01),而Losartan可明显抑制AngⅡ所诱导的胶原ⅠmRNA的表达(P<0.01),而丹参素也可减少胶原ⅠmRNA的表达(P<0.01),川芎嗪虽无统计学意义,但也有减少胶原ⅠmRNA的趋势。AngⅡ同时也增加胶原ⅢmRNA的表达,Losartan可明显抑制AngⅡ所诱导的胶原ⅢmRNA的表达(P<0.01),而丹参素和川芎嗪也可减少胶原ⅢmRNA的表达(P<0.05)。结论活血药的有效组分丹参素和川芎嗪可抑制AngⅡ致心肌间质成纤维细胞胶原Ⅰ和胶原Ⅲ基因表达的增加,具有防止心肌细胞肥大和抗心肌间质纤维化作用,从而防治心脏肥厚。     

隐丹参酮对人皮肤瘢痕胶原基因表达的影响

目的研究隐丹参酮对人皮肤增生性瘢痕I、Ⅲ型前胶原mRNA表达的影响。方法用RT-PCR法检测隐丹参酮对人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达。结果隐丹参酮能明显抑制人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达,并呈剂量依赖性。结论隐丹参酮可通过抑制人皮肤增生性瘢痕I、Ⅲ型前胶原mRNA的表达而起到抑制皮肤增生性瘢痕增殖的作用。     

益气活血法对肾间质纤维化影响的实验研究

目的 观察益气活血中药拮抗肾间质纤维化的作用及对转化生长因子β1mRNA表达的影响.方法 将30只大鼠随机分假手术组(对照组)、模型组和治疗组(中药组),采用单侧输尿管梗阻(UUO)模型,术后第14天观察梗阻肾组织病理改变,应用免疫组织化学方法检测转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的表达.结果 模型组TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达增加,肾间质病变加重,与对照组相比有显著差异(P＜0.05);治疗组与模型组相比,TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达下调,肾间质病变面积明显缩小,差异有显著性(P＜0.05).结论 益气活血中药可能通过下调TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型胶原的表达,从而阻抑肾间质纤维化的进展.     

骨形态发生蛋白-7诱导人肾成纤维细胞间质-上皮转化的研究

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)能否诱导人肾成纤维细胞出现间质-上皮的转化.方法 原代培养获得人肾间质成纤维细胞,传至第3代用于本实验.培养液中添加1 000 ng/L BMP-7 72 h后,观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖,ELISA法测定上清Ⅰ胶原含量,Western blot分析E-cadherin和Pax2蛋白表达.结果 细胞与BMP-7孵育72 h后,出现细胞聚集类似小管细胞团块.与对照组相比,成纤维细胞增殖活性减低,Ⅰ型胶原分泌下降,上皮标志物E-cadherin和肾发生的标志分子Pax2表达增加.结论 肾成纤维细胞至少保持部分它胚胎时的印迹和可塑性,BMP-7可诱导人肾成纤维细胞呈现间质-上皮的转化.     

脂多糖对正常人皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达的调控及意义

目的研究细菌脂多糖（LPS）对增生性瘢痕患者正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA表达的影响,以了解LPS在增生性瘢痕形成中的生物学作用。方法体外培养增生性瘢痕患者瘢痕组织及正常皮肤成纤维细胞,应用不同浓度（0．005—1．0μg／m1）的大肠杆菌LPS（E．coli055：B5）对正常皮肤成纤维细胞进行刺激,并对刺激后细胞传代至表型稳定（第8代）,采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LPS对正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原及胶原酶mRNA的表达的调控作用,观察剂量一效应关系。分别以同一个体相同代数的瘢痕组织成纤维细胞和未经LPS刺激的正常皮肤成纤维细胞做阳性对照和阴性对照。结果LPS刺激浓度在0．005．0．5μg／ml范围内促进正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,抑制胶原酶mRNA表达（均P〈0．01）,均在0．1μg／ml浓度点作用达高峰;当LPS刺激浓度到达1．0μg／ml时,抑制正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达,促进胶原酶mRNA表达,且均显著低于阴性对照组（均P〈0．01）。当LPS刺激浓度为0．1μg／ml时,正常皮肤成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA和胶原酶mRNA表达量与阳性对照组近似（均P〉0．05）。结论在一定浓度范围内LPS促进成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原mRNA表达、抑制胶原酶mRNA表达。LPS可能是增生性瘢痕形成的原始诱导因素之一。