结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据.方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位.结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD( )健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性.结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础.     

QLFATINSTL（93-102aa）是隐球菌抗原MP98CTL优势表位

目的鉴定隐球菌抗原MP98中的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。方法应用数据库SYFPEITHI预测隐球菌MP98中可能存在的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，经流式细胞术分析各抗原肽与HLA-A＊0201的亲合力，经时间分辨荧光法检测外周血单个核细胞（PBMC5）对各抗原肽产生的增殖反应，经细胞毒性实验研究各抗原肽诱导的特异性T细胞的细胞毒杀伤活性，逐步鉴定MP98的HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果位于MP98氨基酸序列肽3（93—102aa）与HLA—A＊0201分子具有较高的亲合力，并都能刺激HLA—A＊0201阳性个体PBMC增殖，并诱导产生具有特异性杀伤活性的CTL。结论肽3QLFATINSTL（93—102aa）是抗原MP98上HLA—A＊0201限制性CD8^＋CTL的优势表位，可作为隐球菌疫苗设计的候选表位。     

原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础.方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4 T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A*0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A*0201限制性CD8 CTL细胞表位.结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A*0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A*0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性.结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA(159～167aa)和LLAEIETDKA(165～174aa)是PBC患者体内HLA-A*0201限制性的CD8 CTL表位.     

丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位免疫学效应研究

目的：研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL（活化的CD8＋T细胞）表位的体内外免疫学效应。方法：采用丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位肽C_181（LLSCLTTPV）和NS2_172（VLQAGLIRV）分别体外刺激HLA-A＊0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）和免疫HLA-A＊0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）/流式细胞术检测表位肽特异性CD8＋T细胞的水平。结果：C_181和NS2_172诱导HLA-A＊0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA-A＊0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞。结论：C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗。     

结核杆菌抗原多表位融合蛋白的重组表达与鉴定

目的:构建含有6个编码结核杆菌抗原HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位基因序列的重组质粒,并在大肠杆菌中诱导表达.方法:选取结核杆菌抗原Rv0309、Rv0173、Ag85A、Ag85C的6个HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,引入Th表位PADRE及木马肽序列,并以RVKR序列作为接头,合成全基因序列,经 PCR扩增后插入融合表达载体pGEX-4T-1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western印迹鉴定重组表达蛋白.结果:成功构建了结核杆菌多表位蛋白的表达质粒,并经IPTG诱导表达了大小约为40 000的融合蛋白.结论:多表位融合蛋白的重组表达为进一步开发新型结核疫苗打下了基础.     

肝癌相关肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位的预测

目的：预测肝癌肿瘤抗原的HLA-A2限制性CTL表位。方法：选择与肝癌相关的肿瘤抗原MAGE-1，MAGE-3，MAGE-8，p53及AFP为研究目标，采用SYFPEITHI基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法进行HLA-A*0201限制性CTL表位预测。结果：共预测出与肝癌相关的肿瘤相关抗原的35个HLA-A2限制性CTL表位。结论：两种预测方法结果的一致性较好。所预测的35个肿瘤抗原HLA-A2限制性CTL表位经实验筛选，鉴定后，可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究。为临床肝癌特异性治疗奠定基础。     

结核杆菌抗原CFP21/MTB12/Rv3881 C的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:预测结核杆菌分泌抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL方法预测分析抗原CFP21/MTBl2/Rv3881c的HLA-A*0201限制性CTL表位,进一步运用NetCTL方法对抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA-A其他等位基因和HLA-B限制性CTL表位进行预测分析.结果:初步筛选出3个候选抗原HLA-A*0201限制性CTL优势表位各4条,分别为CFP21 5-13、13-21、134-142、189-197;MTB12 26-34、36-44、40-48、61-69;Rv3881c 204-212、207-215、234-242、260-268.得到3个候选抗原HLA-A3和HLA-B7限制性CTL优势表位共21条.结论:初步筛选出抗原CFP21/MTB12/Rv3881c潜在的HLA-A*0201、HLA-A3、HLA-B7限制性表位33条.     

HLA-A＊02／24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

HLA-A* 0201限制性GPC3表位肽的初步预测与筛选

目的:筛选HLA-A*0201限制性GPC3优势表位肽,为肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性的免疫细胞治疗提供新的靶标。方法:通过表位预测网站初步筛选HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,T2细胞结合实验筛选优势表位肽。结果:通过三大常用的表位预测网站,共筛选了13个评分较高的表位肽,化学合成表位肽,采用T2细胞结合实验显示,有4个表位肽与HLA-A2呈现较高亲和力。结论:抗原表位预测网站结合T2细胞结合实验能初步筛选亲和力较高的HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,可能用于HCC特异性CTL治疗的候选标靶。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

人宫颈癌基因蛋白B细胞表位及其HLA限制性细胞毒性T细胞表位预测分析

目的:预测人宫颈癌基因(human cervical cancer oncogene,HCCR)蛋白的二级结构,B细胞表位及其HLA-A,B限制性细胞毒性T细胞表位.方法:综合分析二级结构、亲水性、柔韧性、表面可及性与抗原性指数,预测HCCR蛋白的B细胞抗原表位;利用BIMAS,SYFPEITHI和NetCTL方法预测分析其HLA-A*0201限制性CTL表位,运用NetCTL方法对HLA-A的其他等位基因和HLA-B限制性CTL表位进行预测分析.结果:HCCR蛋白的二级结构主要由α-螺旋结构组成,B细胞优势表位位于N端第41～53,216～228,310～325和355～360区段;预测得到5个HLA-A*0201限制性CTL优势表位分别为YLVFLLMYL(152～160),YLFPRQLLI(159～167),LLLHNVVLL(343～351),CLFLGIISI(138～146)和SIPPFANYL(145～153),HCCR蛋白HLA-A,B限制CTL表位主要位于胞外区.结论:应用多参数预测HCCR蛋白B细胞表位及其HLA-A,B限制性细胞毒性T细胞表位,为进一步实验鉴定其表位进而制备单克隆抗体和基于HCCR抗原的肿瘤免疫学治疗奠定了基础.     

MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及结合力分析

目的：寻找并鉴定MUC4 HLA-A^＊0201限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位.方法：结合2种常用表位预测数据库（SYFPEITHI和ProPred-I）和工具,应用多种参数和方法进行综合分析,包括MHC结合力、蛋白酶体切割位点等综合预测方法.预测得到的抗原表位合成相应抗原肽.用T2细胞株测定各肽与HLA-A^＊0201分子的亲和力.结果：综合分析预测得到HLA-A^＊0201的5个可能表位;合成抗原肽经纯化后纯度＞95%;在5个候选表位肽中,LLLGVGTFV（u25-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽与HLA-A^＊0201的结合力较强.结论：多参数表位预测结果和结合力分析实验结果一致性较好,两者联合应用初步认为LLLGVGTFV（1125-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽为MUC4 HLA-A^＊0201限制性CTL表位的可能性最大.     

轮状病毒结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位,为轮状病毒免疫保护机制研究及疫苗的研制奠定基础.方法应用表位亲和力预测软件SYFPEITHI及蛋白酶切位点预测软件PAProc和Fragpredict相结合预测VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位;用分子模拟对候选肽作进一步筛选;标准Fmoc方案合成候选肽,RP-HPLC纯化、分析,质谱进行鉴定;最后用T2细胞株测定候选肽与HLA-A*0201分子的亲和力及稳定性.结果结合SYFPEITHI、蛋白酶切位点预测结果及分子模建结果,选择分值最高同时在C-末端含有蛋白酶切位点的4条肽作为候选表位肽;标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95%,质谱检测结果表明,各肽的相对分子质量与理论值基本一致;在候选的4条表位肽中,TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.66和2.64,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8 h.结论TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位.     

结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201/*03限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:探寻结核分枝杆菌CFP21抗原的同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位。方法:对结核分枝杆菌CFP21抗原的HLA-A*0201候选肽,利用在线数据库预测HLA-A*03限制性的天然表位肽,通过氨基酸置换适当修饰获得对应的改造肽。通过T2A3细胞结合力实验筛选候选肽,用于细胞毒活性实验。结果:在线数据库预测共获得4条母体肽和3条改造肽。结合力实验显示,改造肽p134-1Y2L、p134-1Y2L9L和母体肽p134与HLA-A*03分子均具有较高的结合力。改造肽p134-1Y2L9L和母体肽p134均能诱导CTL反应,但p134诱导出的CTL对靶细胞具有更强的杀伤效应。结论:p134(AVADHVAAV)是同时针对HLA-A*0201/*03型别的广谱CTL表位。     

SARS冠状病毒E蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位的预测

目的预测SARS冠状病毒E蛋白的HLA-A·0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法联合应用超基序法和量化矩阵法.结果预测出13个九肽CTL表位.结论通过对SARS冠状病毒E蛋白抗原CTL表位进行预测,从而为SARS冠状病毒E蛋白CTL表位的实验探测和鉴定提供了线索,为认识CTL介导的细胞免疫机制以及基于CTL表位的疫苗研制提供了基础资料.     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖

目的 探索免疫球蛋白重链可变区(IgHV)是否存在T细胞识别的表位。方法 PCR扩增108例急性淋巴细胞白血病(ALL)的7个IgHV家族的重排基因,PCR产物直接测序并翻译成氨基酸。利用互联网生物信息资源分析B-ALL IgHV基因的重排类型和基因变异,利用SYFPEITHI和BIMAS软件预测IgHV基因编码蛋白质的T细胞表位。合成代表性九肽IgHV1家族的QLVQSGAEV,进行12结合分析、合成九肽诱导的T细胞扩增、扩增细胞的HLA-A*0201／QLVQSGAEV四聚体检测等实验,确定合成九肽的免疫原性。结果 66％的B-ALL检测到IgHV基因重排克隆。在40份测序得到的B-ALL IgHV序列中,选出26份进行HLA-A*0201分子结合九肽的预测,发现7个IgHV家族共有12条抗原九肽。除1条位于第3互补决定区(CDR3)外,10条(83％)位于框架区(FR),并与相应胚系VH家族的代表序列相同;为同一IgHV家族的白血病细胞所共有。合成的IgHV1抗原九肽可将12细胞表面HLA-A*0201分子的表达提高1．63倍。HLA-A*0201正常供者的外周血淋巴细胞接受该九肽负荷的自身PBMC的1轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞达1．64％,继续接受该九肽负荷的12细胞的2轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞增至82．57％。结论 B淋巴细胞的免疫球蛋白重链框架区有CTL识别的IgHv家族特异的抗原九肽,正常人外周血T细胞库存在这些抗原九肽特异的CTL,这些抗原九肽可诱导特异性CTL的增殖。