原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础.方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4 T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A*0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A*0201限制性CD8 CTL细胞表位.结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A*0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A*0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性.结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA(159～167aa)和LLAEIETDKA(165～174aa)是PBC患者体内HLA-A*0201限制性的CD8 CTL表位.     

结核杆菌抗原CFP21/MTB12/Rv3881 C的HLA限制性细胞毒T淋巴细胞表位预测

目的:预测结核杆菌分泌抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL方法预测分析抗原CFP21/MTBl2/Rv3881c的HLA-A*0201限制性CTL表位,进一步运用NetCTL方法对抗原CFP21/MTB12/Rv3881c的HLA-A其他等位基因和HLA-B限制性CTL表位进行预测分析.结果:初步筛选出3个候选抗原HLA-A*0201限制性CTL优势表位各4条,分别为CFP21 5-13、13-21、134-142、189-197;MTB12 26-34、36-44、40-48、61-69;Rv3881c 204-212、207-215、234-242、260-268.得到3个候选抗原HLA-A3和HLA-B7限制性CTL优势表位共21条.结论:初步筛选出抗原CFP21/MTB12/Rv3881c潜在的HLA-A*0201、HLA-A3、HLA-B7限制性表位33条.     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据.方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位.结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD( )健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性.结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础.     

HLA-A* 0201限制性GPC3表位肽的初步预测与筛选

目的:筛选HLA-A*0201限制性GPC3优势表位肽,为肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)特异性的免疫细胞治疗提供新的靶标。方法:通过表位预测网站初步筛选HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,T2细胞结合实验筛选优势表位肽。结果:通过三大常用的表位预测网站,共筛选了13个评分较高的表位肽,化学合成表位肽,采用T2细胞结合实验显示,有4个表位肽与HLA-A2呈现较高亲和力。结论:抗原表位预测网站结合T2细胞结合实验能初步筛选亲和力较高的HLA-A*0201限制性GPC3表位肽,可能用于HCC特异性CTL治疗的候选标靶。     

结核分枝杆菌抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性CTL表位预测

目的:预测结核分枝杆菌(MTB)相关抗原Rv1258c、Rv1410c及Rv3425的HLA限制性细胞毒性T细胞(CTL)表位.方法:通过NCBI数据库获取各蛋白的氨基酸序列,利用BLAST分析其与人类蛋白质的同源性,利用SYFPEITHI、BIMAS和NetCTL数据库预测分析MTB相关抗原的HLA-A2与HLA-A...     

SARS冠状病毒E蛋白HLA-A*0201限制性CTL表位的预测

目的预测SARS冠状病毒E蛋白的HLA-A·0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法联合应用超基序法和量化矩阵法.结果预测出13个九肽CTL表位.结论通过对SARS冠状病毒E蛋白抗原CTL表位进行预测,从而为SARS冠状病毒E蛋白CTL表位的实验探测和鉴定提供了线索,为认识CTL介导的细胞免疫机制以及基于CTL表位的疫苗研制提供了基础资料.     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

丙型肝炎病毒CTL-Th表位嵌合DNA疫苗的构建

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)CTL-Th表位嵌合DNA疫苗并探讨其体内免疫学效应。方法:基于我们前期从HCV中鉴定的4条HLA-A*0201限制性CTL(细胞毒性T细胞)表位(NS4b78-86、NS5a367-375、C181-189和NS2172-180),2条HLA-A*1101限制性CTL表位(NS3609-617和NS5b251-259),1条HLA-A*2402限制性CTL表位(NS5b382-390)和2条Th(辅助性T细胞)表位(P73-15和NS5A276-288),合成编码串联CTL表位和Th表位的基因并克隆入真核表达质粒pc DNATM3.1/myc-His(-)A;阳性重组质粒分别免疫HLA-A*0201、HLA-A*1101和HLA-A*2402转基因小鼠,采用ELISPOT实验和CTL杀伤实验检测小鼠脾细胞内单个CTL表位特异性T细胞的水平及其杀伤靶细胞的效应。结果:合成了含有Kozak序列和编码Igκ信号链序列、7条CTL表位、2条Th表位的基因序列并顺利克隆入了真核表达质粒。阳性重组质粒免疫三种转基因小鼠后,采用ELISPOT实验检测到小鼠脾细胞内存在单个CTL表位特异性分泌IFN-γ的CTL,后者可杀伤负载单个CTL表位的脾细胞。结论:成功构建了可诱导CTL反应的HCV的CTL-Th表位嵌合DNA疫苗。     

轮状病毒结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位的初步鉴定

目的预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位,为轮状病毒免疫保护机制研究及疫苗的研制奠定基础.方法应用表位亲和力预测软件SYFPEITHI及蛋白酶切位点预测软件PAProc和Fragpredict相结合预测VP6 HLA-A*0201限制性CTL表位;用分子模拟对候选肽作进一步筛选;标准Fmoc方案合成候选肽,RP-HPLC纯化、分析,质谱进行鉴定;最后用T2细胞株测定候选肽与HLA-A*0201分子的亲和力及稳定性.结果结合SYFPEITHI、蛋白酶切位点预测结果及分子模建结果,选择分值最高同时在C-末端含有蛋白酶切位点的4条肽作为候选表位肽;标准Fmoc方案合成的各肽纯度均大于95%,质谱检测结果表明,各肽的相对分子质量与理论值基本一致;在候选的4条表位肽中,TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)与HLA-A*0201呈高亲和力结合,荧光系数(flurorescene index,FI)分别为2.66和2.64,同时肽-HLA-A*0201复合物半数解离时间(dissociation complex50,DC50)均大于8 h.结论TLLANVTAV(340-348)和VLADANETL(333-341)为潜在的HLA-A*0201限制性CTL表位.     

基于抗原表位分析的P-糖蛋白表达研究

目的:对P-糖蛋白抗原表位进行分析和表达研究.方法:联合运用多种方法对P-糖蛋白的二级结构和表面特性进行分析,运用化学和酶法相结合的技术合成P-糖蛋白基因,再克隆入表达载体pGEX-2T进行表达、鉴定及纯化.结果:位于P-糖蛋白胞外段的抗原表位位点仅见于氨基酸残基82as～115as(Ⅰ)、741aa～760aa(Ⅳ)及800aa～816aa(Ⅴ). SDS-PAGE分析,表达出约29 kD大小的蛋白.结论:该基因片段的高效表达为进一步制备其抗体或筛选其特异性结合肽,进行靶向治疗等工作奠定了基础.     

精子抗原表位的研究进展

精子是一种隐蔽抗原,可引起机体产生抗精子抗体。抗精子抗体能够影响生殖细胞的结合、胚胎着床等过程,进而导致免疫性不孕不育。近年来,与免疫性不孕不育密切相关的抗精子抗体所结合的精子表面抗原及其抗原表位已成为抗精子抗体检测及避孕疫苗的主要研究对象之一。该文对与免疫性不孕不育相关的精子表面抗原及其抗原表位的筛选和鉴定,以及当前精子抗原表位研究所面临的难点作一简要的综述。     

Partial protection induced by phage library- selected peptides mimicking epitopes of Schistosoma japonicum

Objective To obtain peptide mimicking epitopes of Schistosoma japonicum(S.japonicum)through screenging of a phage peptide library and to test their potential for induction of protection.Methods S.japonicum infected sera from Microtus fortis(IMFS)and normal sera from Microtus fortis (NMFS)were used respectively to screen a 12-mers random peptide library by testing the reactivity of anti S.japonicum serum with the phagotopes.After three rounds of biopanning,the pooled phages were used to immunize mice,after which challenge infection was performed.Results Of 12 randomly picked clones,10 clones selected using IMFS and 7 clones selected using NMFS were shown to be antigenic.Significant reduction in adult worms(22.6?and a high reduction(68.9?in liver eggs were achieved following immunization with phages screened with IMFS.However,no protection was elicited by those selected with NMFS.Conclusion The results show that the phagotopes are both antigenic and immunogenic,suggesting a potential use of phage displayed peptide as novel vaccines against S.japonicum.     

人抑制素不同亚基抗原表位表达及抗体制备

目的:根据人抑制素α?βA?βB 3个亚基特点,选择各亚基特定的抗原表位进行融合表达,并制备相应的多克隆抗体?方法:根据各亚基抗原表位氨基酸序列,合成其基因序列,并选用大肠杆菌偏爱密码子,插入pGEX-4T-2中作融合表达,纯化表达产物,免疫绵羊,制备抗体,测定了抗体水平?结果:经酶切鉴定,分别获得抑制素α?βA?βB与pGEX-4T-2连接的阳性重组子pGEX-INHA?pGEX-INHBA?pGEX-INHBB?其表达产物GST-INHA?GST-INHBA?GST-INHBB及纯化后融合蛋白,经考马斯亮蓝染色鉴定,大小正确?用常规免疫法免疫绵羊抗体,经ELISA检测抗体效价,结果显示,直接提取融合蛋白GST-INHA?GST-INHBA?GST-INHBB免疫绵羊抗体效价分别为:1∶64?1∶128?1∶32,纯化后的融合蛋白GST-INHA?GST-INHBA?GST-INHBB免疫绵羊抗体效价分别为:1∶32?1∶32?1∶64?结论:可在本研究所制备的抗体的基础上建立测定血清抑制素水平的免疫诊断方法?     

牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

目的分析牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B、T细胞表位,为探索基于抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法从Uniprot数据库中获得牡蛎过敏原Cra g 1的氨基酸序列,通过DNA Star Protean软件,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析其二级结构;采用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法、Jameson-Wolf法综合分析Cra g 1主要的B细胞抗原表位。使用SYFPEITHI和NetMHC-Ⅱ在线网站分析T细胞抗原表位。结果牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构主要为α-螺旋,其B细胞表位接近覆盖Cra g 1氨基酸全序列;而T细胞优势表位位于第89～103、108～122、129～143位肽段。结论本研究分析牡蛎过敏原Cra g 1的B、T细胞优势表位,为日后Cra g 1的基础免疫学研究,如疫苗的研制、诊断试剂的制备和其抗原性改造等提供了理论依据。     

血浆载脂蛋白B上的4－羟基壬烯醛抗原决定簇表达与冠心病的关系

为了探索载脂蛋白Ｂ（ａｐｏＢ）上的醛类抗原决定簇与冠心病的关系，本研究联合应用针对４－羟基壬烯醛（ＨＮＥ）抗原决定簇的抗体和抗ａｐｏＢ抗体，建立了双抗体酶联免疫吸附试验，并对１６０名健康体检者和１０３例冠心病患者血清ａｐｏＢ上的ＨＮＥ抗原决定簇的表达进行了检测。测定结果表明，冠心病患者组的平均水平（１８３．５±６３．６ｍｇ／Ｌ，ｎ＝１０３）高于正常对照组（１３３．３±４７．５ｍｇ／Ｌ，ｎ＝１６０），差异有显著性意义。多元回归分析结果表明，ａｐｏＢ上的ＨＮＥ抗原决定簇的表达水平、血清ＬＤＬ胆固醇水平以及年龄均与冠心病呈正相关，而血清高密度脂蛋白胆固醇的水平和女性则与冠心病呈负相关，从而证明ａｐｏＢ上的ＨＮＥ抗原决定簇的表达增高，可能是冠心病的一个独立危险因子。     

肿瘤抗原MAGE-2 HLA-A2限制性新CTL表位的鉴定

目的：寻求新的HLA-A2限制性肿瘤抗原MAGE-2 CTL表位。方法：经超基序与量公基序相结合预测的肿瘤抗原MA-GE-2的4个表位作为研究对象，标准的^51Cr实验与肽结合实验相结合进行验证。结果：预测表位肽MAGE-2220-228，MAGE-2271-279经体外刺激PBMC后可有效的诱导CTL效应产生，当效/靶为100：1时溶破靶细胞效率分别为74.4％，68.2％。HLA-A2分子亲和力分析，荧光系数分别为0.61、0.24阳性肽荧光系数为0.79。结论：多肽MAGE-2 220-228可作为新的HLA-A2限制性CTL表位。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)功能区表位。方法 应用差减筛选法,以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库,通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选,从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合,而不与正常小鼠IgG结合,其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41.6%)及亲水氨基酸(最高达91.67%)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位,为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

甲型流感病毒核蛋白的表达与鉴定及其B细胞表位的预测

目的构建甲型流感病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)的原核表达载体,诱导NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定;预测人NP蛋白的B细胞抗原表位。方法以pcDNA3.1(+)/NP为模板,利用PCR方法扩增目的片段NP,再将此片段插入原核表达载体pET-32a(+),并进行PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定,将鉴定正确的质粒转入表达菌Rosetta-gami(2)中,用异丙基-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白的表达,用SDS-PAGE和Western Blot检测表达产物。按Chou-Fasman和Gamier-Robson方法预测其编码蛋白的二级结构,采用Karplns-Schulz方法预测蛋白骨架区的柔韧性;用Kyte-Doolittle方法预测其亲水性,Emini方法预测蛋白质表面可能性及Jameson-Wolf方法预测抗原性指数。结果成功构建了流感病毒核蛋白(NP)的原核表达载体,经SDS-PAGE检测NP蛋白得到了表达,Western Blot证明表达的重组蛋白具有免疫活性。在蛋白质第6～11、79～91、241～248和319～326区段附近很可能为B细胞表位优势区域。结论流感病毒核蛋白的表达及B细胞表位的预测为流感病毒的快速诊断试剂的研发工作提供了基础。     

肿瘤相关蛋白EIF4G1亚型的B细胞表位预测

目的预测肿瘤相关蛋白EIF4G1亚型的B细胞表位。方法下载EIF4G1蛋白各种亚型的氨基酸序列,以单参数(亲水性、可及性、柔韧性、抗原性)预测为基础,结合ABCpred和二级结构预测筛选等方法综合筛选EIF4G1蛋白质亚型特异性的B细胞表位。结果目前已知EIF4G1蛋白的亚型有5种,亚型间的氨基酸变化局限在一个由300个氨基酸形成的序列区域,亚型特异性的B细胞表位可能位于该区域的14~19、21~27、52~61、106~112、113~139、183~189、201~216和217~224位氨基酸残基区域内或附近。结论EIF4G1蛋白质亚型间存在特异性B细胞表位,这些表位对应用合成肽抗原检测蛋白质亚型和进行肿瘤患者的早期诊断具有重要指导意义。