结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的：预测及鉴定结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，为基于表位的结核疫苗研究提供依据。方法：应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A＊0201限制性T细胞表位，利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HL-A＊0201分子的亲合力，选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞，检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性，逐步鉴定出Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位。结果：SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA—A＊0201分子的抗原肽，其中3个抗原肽（170～178aa、317～325aa和144～153aa）显示与T2细胞上HLA-A＊0201分子有高结合力，而抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）能够诱导大多数HLA—A＊0201阳性结核患者及PPD（＋）健康志愿者产生特异性CTL细胞，并分泌大量的IFN-γ，能够诱导CTL体外发生增殖，能够产生特异性杀伤活性。结论：成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL（144～153aa）结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A＊0201限制性CD8^＋CTL表位，可作为结核疫苗设计的候选表位，为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础。     

原发性胆汁性肝硬化患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶特异性CD8+CTL表位预测及鉴定

目的鉴定原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者中自身抗原丙酮酸脱氢酶(PDC-E2)上的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为临床探索特异性免疫治疗奠定基础.方法应用数据库SYFPEITHI预测PDC-E2上两段涵盖B细胞表位和CD4 T细胞表位的氨基酸序列(163～184aa和36～49aa)附近可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,再通过T2细胞株、细胞增殖试验和细胞毒性检测分别分析各抗原肽与HLA-A*0201的结合力、诱导患者外周血单个核细胞(PBMCs)增殖能力及抗原肽诱导的抗原特异性T细胞杀伤毒性,逐步鉴定HLA-A*0201限制性CD8 CTL细胞表位.结果数据库初步预测到5个可能性较大的HLA-A*0201限制性抗原肽,其中两个抗原肽(159～167aa和165～174aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有较高的亲和力,这两个抗原肽能刺激大部分HLA-A*0201阳性PBC患者PBMC增殖,并且由其诱导产生的CTL具有特异杀伤活性.结论位于PDC-E2内酯酰区上的KLSEGDLLA(159～167aa)和LLAEIETDKA(165～174aa)是PBC患者体内HLA-A*0201限制性的CD8 CTL表位.     

抗原肽HPV18 E77-15诱导产生特异性细胞毒T细胞的实验研究

目的探讨HLA—A2限制性表位HPV18E77—15的免疫原性。方法对抗原肽HPV18E7-15进行T2结合分析;通过体外细胞培养技术抗原肽诱导特异性CTL扩增;采用RPE标记的表位特异性五聚体和FITC标记的CD8＋抗体通过流式细胞仪检测抗原肽所诱导产生的特异性CTLs。结果抗原肽HPVl8E77—15可将T2细胞表面HLA—A＊0201分子的表达提高2．6倍;在流式细胞仪检测中,抗原肽HPV18E77—15刺激诱导产生CD8＋五聚体＋双阳性的抗原肽特异性CTLs为1．87％。结论抗原肽HPV18E77—15能够诱导HLA—A2阳性正常人外周血淋巴细胞产生特异性CTLs,表明HPV18E77-15具有一定的免疫原性。     

结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位的预测及鉴定

目的:预测及鉴定结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,为基于表位的结核疫苗研究提供依据.方法:应用SYFPEITHI数据库预测结核杆菌抗原Ag85C序列中可能存在的HLA-A*0201限制性T细胞表位,利用T2细胞株分析各预测的抗原肽与HLA-A*0201分子的亲合力,选取高亲合力肽诱导特异性CTL细胞,检测各高亲合力肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN-γ水平、在体外的CTL增殖反应以及细胞杀伤毒性,逐步鉴定出Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位.结果:SYFPEITHI数据库从Ag85C序列中预测到14条能够结合HLA-A*0201分子的抗原肽,其中3个抗原肽(170～178 aa、317～325 aa和144～153 aa)显示与T2细胞上HLA-A*0201分子有高结合力,而抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)能够诱导大多数HLA-A*0201阳性结核患者及PPD( )健康志愿者产生特异性CTL细胞,并分泌大量的IFN-γ,能够诱导CTL体外发生增殖,能够产生特异性杀伤活性.结论:成功鉴定出抗原肽FLTREMPAWL(144～153 aa)结核杆菌抗原Ag85C的HLA-A*0201限制性CD8 CTL表位,可作为结核疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型有效的抗结核疫苗奠定了基础.     

丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位免疫学效应研究

目的：研究前期实验鉴定的2条丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL（活化的CD8＋T细胞）表位的体内外免疫学效应。方法：采用丙型肝炎病毒HLA-A＊0201限制性CTL表位肽C_181（LLSCLTTPV）和NS2_172（VLQAGLIRV）分别体外刺激HLA-A＊0201阳性健康志愿者外周血单个核细胞（PBMCs）和免疫HLA-A＊0201转基因小鼠,采用酶联免疫斑点实验（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）/流式细胞术检测表位肽特异性CD8＋T细胞的水平。结果：C_181和NS2_172诱导HLA-A＊0201阳性PBMCs产生了高水平的肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞;在C_181和NS2_172免疫的HLA-A＊0201转基因小鼠脾细胞中检测到了肽特异性分泌IFN-γ的细胞和肽特异性IFN-γ＋CD8＋T细胞。结论：C_181和NS2_172具有较好免疫学效应,有望用于研发CTL表位肽疫苗。     

HLA-A＊02／24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

HLA-A·02/24限制的HBcAg表位特异性细胞毒T细胞克隆的建立及分析

目的建立HLA-A＊0201／2403限制的HBcAg表位特异性CTL细胞克隆。方法HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的外周血单个核细胞（PBMC）分别用限制性表位肽HBc18-27和HBc117-125刺激,并以有限稀释法进行克隆化,期间单独使用植物血凝素（PHA）及联合使用表位肽刺激。用免疫荧光、流式细胞术以及乳酸脱氢酶释放实验对所获克隆进行鉴定。结果从HBc18-27活化的细胞中获得29株细胞克隆,其中28株为CD8^＋T克隆,均具有特异性细胞毒活性。从HBc117-125激活的细胞中获得12株CD8＋T克隆,其中9株有明显的细胞毒活性,另3株细胞毒活性则显著低下。克隆化过程中单独使用PHA及联合使用表位肽,克隆形成率分别为15.62％和14.58％。结论分别用表位肽HBc18-27和HBc117-125,能激活HLA-A＊0201／2403阳性HBV感染者的CD8^＋T细胞。建立CD8^＋T克隆过程中,表位肽的使用不能提高克隆形成率。     

树突状细胞吞噬PLA-AFP 218-226微球后诱导细胞毒性T淋巴细胞反应

目的研究树突状细胞（DC）吞噬包被有甲胎蛋白HLA—A2限制性表位肽（AFP218-226，LLNQHACAV）的聚乳酸微球（PLA—AFP218-226）后诱导的特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对肝癌细胞株HepG2和负载有AFP218-226的T2细胞株的毒性作用。方法用GM—CSF和IL-4诱导HLA—A2^＋的健康志愿者外周血单核细胞，LPS诱导成熟，使其分化为高纯度DC，在诱导过程中加入PLA—AFP218-226微球，用吞噬了PLA—AFP218-226微球的DC诱导自身T淋巴细胞，使其成为肝细胞癌（HCC）特异性CTL。用流氏细胞仪检测DC膜分子标志，T2细胞与AFP218-226结合实验检测HLA—A2分子与AFP218-226之间的亲合力，MTT法检测特异性CTL杀伤HepG2和T2细胞株的能力。结果AFP218-226与HLA—A2分子具有较高的亲合力，吞噬微球后的成熟DC高表达CD83、CD86、CD40等膜分子，其诱导的特异性CTL对HepG2和负载有AFP218-226的T2细胞株具有强的细胞毒作用。结论PLA—AFP218-226被DC细胞吞噬后，能够诱导HCC特异性CTL的产生，可能成为一种新型的抗肿瘤表位肽疫苗，在肝癌的防治中得到应用。     

MUC4 HLA-A*0201限制性CTL表位的预测及结合力分析

目的：寻找并鉴定MUC4 HLA-A^＊0201限制性细胞毒性T细胞（CTL）表位.方法：结合2种常用表位预测数据库（SYFPEITHI和ProPred-I）和工具,应用多种参数和方法进行综合分析,包括MHC结合力、蛋白酶体切割位点等综合预测方法.预测得到的抗原表位合成相应抗原肽.用T2细胞株测定各肽与HLA-A^＊0201分子的亲和力.结果：综合分析预测得到HLA-A^＊0201的5个可能表位;合成抗原肽经纯化后纯度＞95%;在5个候选表位肽中,LLLGVGTFV（u25-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽与HLA-A^＊0201的结合力较强.结论：多参数表位预测结果和结合力分析实验结果一致性较好,两者联合应用初步认为LLLGVGTFV（1125-33）和LLGVGTFVV（1126-34）2个九肽为MUC4 HLA-A^＊0201限制性CTL表位的可能性最大.     

树突状细胞肺癌疫苗制备的实验研究

①目的 探讨具有较强免疫活性树突状细胞（DC）的制备及其鉴定。②方法 采用3M KCL提取法和弱酸洗脱法获得肺癌细胞GLC-82的可溶性抗原多肽，并定量抗原多肽浓度；用GLC-82细胞抗原多肽；中击致敏，从人外周血PBMC中用GM—CSF、IL-4和TNF—α体外诱导扩增并经鉴定的DC；利用负载GLC-82细胞抗原多肽的DC，刺激同种异体外周血T淋巴细胞活化增殖，诱导产生具有识别肺癌细胞抗原的特异性CTL；③结果 人体外周血PBMC体外经7天诱导出的DC，具有典型的树突状细胞特性，经GLC-82抗原致敏的DC诱导同种异体T淋巴细胞活化增殖产生CTL，高表达CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋，且随培养时间延长，CD3^＋和CD8^＋ T 细胞百分率增加，CD4^＋／CD8^＋比例下降，动态观察CTL增殖倍数迅速增加；④结论 利用3Mkcl单盐提取法制备肿瘤可溶性抗原，并以终浓度50ng,／mL冲击致敏，从外周血PBMC中分离、扩增、活化的DC，使其负载肿瘤抗原，体外诱导能产生特异性CTL。     

淋巴瘤相关抗原肽刺激所获细胞毒性T细胞克隆的特征

目的研究抗肿瘤细胞毒性T淋巴细胞(CTL)克隆识别靶细胞的肽特异性和人类白细胞抗原(HLA)限制性,以及其赖以识别抗原肽的T细胞受体(TCR)基因表达序列的分子特征。方法利用体外CTL刺激扩增体系,应用免疫球蛋白重链可变区(IgHV)框架区上的B淋巴瘤相关抗原九肽(IgHV1QLVQSGAEV和IgHV3SLYLQMNSL)负荷的抗原递呈细胞(APC),刺激正常HLAA0201供者的外周血单个核细胞(PBMC),每周1次共4次,用流式细胞仪检测体外培养细胞的免疫表型的变化,并用肽/主要组织相容性基因复合体(MHC)四聚体方法检测肽特异性的CTL增殖情况。应用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测CTL与不同的靶细胞共同孵育时释放干扰素γ(IFNγ)的能力。应用逆转录多聚酶链反应(RTPCR)和T细胞受体(TCR)基因指纹谱型图方法检测培养前后的淋巴细胞的克隆变化,并用直接测序的方法得到CTL克隆的TCR基因序列。结果B淋巴瘤相关抗原肽4次刺激体外培养的PBMC后CD8+CTL大量增殖,CD4/CD8明显下降(0.10vs1.43,P<0.05)。IgHV1QLVQSGAEV/HLAA0201四聚体和CD8双阳性的肽特异性CTL数量(49.38%)比刺激前(0.04%)明显上升。ELISA检测IFNγ的分泌表明其识别靶细胞是肽特异性和HLA限制性的。TCR基因指纹谱型图显示抗原肽反复刺激获得的CTL的TCR表达集中于个别基因家族,呈克隆性增殖。结论应用IgHV基因框架区来源的B淋巴瘤相关抗原九肽可以使特异性CTL克隆增殖,这些克隆以肽特异性和HLA限制性的方式识别靶细胞。了解这些CTL的作用和TCR识别相关抗原肽的分子结构,将有助于确定体内T细胞和B细胞相互调节的机制。     

丙型肝炎病毒HLA-A＊1101和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位的研究

目的：鉴定出丙型肝炎病毒（HCV）特异性HLA-A＊1101限制性和A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.方法：采用T细胞表位预测软件SYFPEITHI预测HCV特异性CD8＋T细胞表位,合成HLA-A＊1101限制性、A＊2402限制性候选表位;建立永生化的HLA-A＊1101阳性、A＊2402阳性B细胞株,采用竞争性肽结合实验检测候选表位与HLA-A＊1101或A＊2402分子的结合力;候选表位体外分别刺激HLA-A＊1101阳性或A＊2402阳性HCV感染者外周血单个核细胞（PBMCs）后,采用酶联免疫斑点（ELISPOT）和细胞内细胞因子染色（ICS）实验分别检测肽特异性分泌γ-干扰素（IFN-γ）的细胞的水平和（肝） 异性IFN-γ＋CD8＋T细胞的水平.结果：5条HLA-A＊1101限制性候选表位中,NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（VVFSDMETK）与HLA-A＊1101分子具有高结合力.3条HLA-A＊2402限制性候选表位中,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）与HLA-A＊2402具有高结合力;在HLA-A＊1101阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3 609和NS2_165特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞,而在HLA-A＊2402阳性HCV感染者PBMCs中存在NS3_373和NS5b 382特异性分泌IFN-γ的CD8＋T细胞.结论：本研究证实NS3_609（ITLTHPITK）和NS2_165（WFSDMETK）为全新的HCV特异性HLA-A＊1101限制性CD8＋T细胞表位,NS3_373 （KCDELASKL）和NS5b_382 （YYLTRDPTI）为全新的HCV特异性HLA-A＊2402限制性CD8＋T细胞表位.     

HLA—B27限制性CD8^＋T细胞反应在调节HCV清除和病毒进化中的重要作用

病毒特异性CD8^＋T细胞反应在感染的自然进程中具有重要作用，但是CD8^＋T细胞反应对临床预后的影响则未见报道。一项针对女性HCV感染的单因素研究发现，HLA—B27与病毒的自发清除明显相关，但这种关系的免疫学基础仍不清楚。该研究清楚地揭示了HLA—B27在HCV感染中的保护作用。大多数痊愈的HLA—B27女性患表现出HLA—B27限制性丙型肝炎（HCV）特异性CD8^＋T细胞表位的特征。针对慢性HCV感染的相关病毒序列分析，展示了表位序列变异和HLA—B27表达之间的关系，揭示了人群中等位基因的特异性选择。而针对3例慢性HCV感染的功能性分析，则发现病毒表位的变异代表病毒逃逸的变化。总之。该研究揭示了HLA—B27在调节病毒自发性清除和病毒进化中的重要作用，以及与新的CD8^＋T细胞表位之的功能相关性。     

多表位组合肽诱导HLA-A2+人PBMC产生抗原特异性CD8+ T细胞应答的研究

目的 探讨基于HBV抗原优势表位的治疗性多肽抗原组分、结构与体外诱导CD8^ T细胞应答之间的关系。方法 用计算机辅助分子设计技术，设计基于HBV抗原免疫优势性CTL表位、B细胞表位和破伤风类毒素通用Th细胞表位的3种治疗性多肽候选疫苗分子，经Merrifield固相多肽合成技术合成，并经HPLC纯化、鉴定。以HLA-A2^ 健康人和慢性乙型肝炎患者的PBMC为实验对象，进行体外诱导CD8^ T细胞应答的免疫学功能研究。结果所设计治疗性多肽分子可在体外诱导较强的抗原特异性CD8^ CTL应答；“-AAA-”铰链区设计和“Th B”细胞表位的引入可增强CTL表位肽的免疫原性。结论 提示在治疗性表位多肽疫苗的分子设计中，短而高柔性的“铰链区”设计和“Th B”细胞表位的引入可显著提高小分子表位肽的免疫原性。     

HLA-A^＊0201限制性AFP抗原决定簇肽特异性肝癌疫苗的制备

目的探讨人HLA-A^＊0201限制性AFP抗原决定簇肽（含MHC—I类分子HLA-A^＊0201）作为原发性肝癌特异性抗原制备肝癌肿瘤疫苗的可行性。方法应用14佃AFP抗原决定簇肽片段分别体外脉冲刺激健康人血液树突状细胞（DC）,将DC与自体T淋巴细胞共同培养并扩增其数量,使AFP抗原决定簇肽导入CD8’阳性T淋巴细胞（CD8^＋-CTL）并对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞（人慢性髓原性白血病细胞株K562转染人HLA-A^＊0201基因）产生特异性杀伤并释放gamma-干扰素（ELISPOT测定）。结果有4个AFP抗原决定簇肽对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞杀伤能力较强,称之为免疫决定簇肽（Immunodominant）;另有10个AFP抗原决定簇肽对表达相应AFP抗原决定簇肽的K562／A2．1细胞杀伤能力较弱,称之为亚免疫决定簇肽（Subdominant）。结论AFP抗原决定簇肽可以作为肝癌特异性抗原制备肝癌肿瘤疫苗,K562／A2．1细胞可以作为有效的抗原提呈细胞（APC）用于实验研究。     

肿瘤抗原MAGE-n HLA-A2限制性细胞毒性T细胞表位的预测及合成鉴定

目的　采用表位重建技术 ,对预测MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位结合活性进行研究。方法　用SYFPEITHI超基序法远程预测系统和量化基序多项式法结合的预测方法 ,筛选新的MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位作为候选表位。对预测的抗原表位进行多肽合成 ,并用HPLC进行纯化 ,质谱法 (MS)鉴定。候选表位与HLA A2位点的亲和力及结合稳定性用竞争结合抑制实验、T2结合稳定性实验及MHC 肽复合体稳定性实验测定。结果　用表位预测法筛选MAGE n抗原 5个HLA A2限制性CTL表位为候选表位。QLVFGIEVV(15 9 16 7)、IMPKTGFLI(195 2 0 3)和FLIIVLVMI(2 0 1 2 0 9) 3个表位具有较高的HLA A2结合力 (IC50 <15 μM)和结合稳定性 (DT5 0 >6h) ,可作为MAGE n抗原HLA A2限制性CTL候选表位进行进一步研究。结论　表位预测结合表位重建方法可提高肿瘤抗原CTL表位研究的效率。MAGE n抗原HLA A2限制性CTL表位经免疫学鉴定后 ,可望用于新型肝癌治疗性多肽疫苗的设计研究 ,为临床肝癌特异性治疗奠定基础。     

人类白细胞抗原—抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞的诱生及克隆

为建立一种有效诱导及克隆人类白细胞抗原（HLA）－抗原肽复合物特异性细胞毒性T细胞（CTL）的方法,用EB病毒转化的B淋巴母样细胞系细胞作为刺激细胞,采用长期混合淋巴细胞培养法诱导自身外周血T细胞库中抗原肽－HLA复合物特异性CTL增殖、分化,并用有限稀释法对之进行克隆。通过细胞毒实验证实获得的CD3^ 、CD8^ T细胞克隆具有高度抗原特异性并受某些HLA型别的限制。     

免疫球蛋白重链框架区的抗原九肽诱导特异性细胞毒T细胞增殖

目的 探索免疫球蛋白重链可变区(IgHV)是否存在T细胞识别的表位。方法 PCR扩增108例急性淋巴细胞白血病(ALL)的7个IgHV家族的重排基因,PCR产物直接测序并翻译成氨基酸。利用互联网生物信息资源分析B-ALL IgHV基因的重排类型和基因变异,利用SYFPEITHI和BIMAS软件预测IgHV基因编码蛋白质的T细胞表位。合成代表性九肽IgHV1家族的QLVQSGAEV,进行12结合分析、合成九肽诱导的T细胞扩增、扩增细胞的HLA-A*0201／QLVQSGAEV四聚体检测等实验,确定合成九肽的免疫原性。结果 66％的B-ALL检测到IgHV基因重排克隆。在40份测序得到的B-ALL IgHV序列中,选出26份进行HLA-A*0201分子结合九肽的预测,发现7个IgHV家族共有12条抗原九肽。除1条位于第3互补决定区(CDR3)外,10条(83％)位于框架区(FR),并与相应胚系VH家族的代表序列相同;为同一IgHV家族的白血病细胞所共有。合成的IgHV1抗原九肽可将12细胞表面HLA-A*0201分子的表达提高1．63倍。HLA-A*0201正常供者的外周血淋巴细胞接受该九肽负荷的自身PBMC的1轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞达1．64％,继续接受该九肽负荷的12细胞的2轮刺激,CD8^ 四聚体^ 细胞增至82．57％。结论 B淋巴细胞的免疫球蛋白重链框架区有CTL识别的IgHv家族特异的抗原九肽,正常人外周血T细胞库存在这些抗原九肽特异的CTL,这些抗原九肽可诱导特异性CTL的增殖。     

HCV蛋白酶研究中病毒适应与免疫逃逸的关系

背景：丙型肝炎病毒（HCV）可在非结构性（NS）3／4A蛋白酶的人白细胞抗原（HLA）-Ⅰ限制性免疫优势表位发生突变，从而逃逸细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的识别，使病毒感染持续。然而，该突变并非不受限制，有时甚至完全缺如，实验室亦未能确定病毒突变的影响因素。目的：探讨在NS3蛋白酶1073—1081残基处CTL免疫优势表位的突变是否受病毒适应性的限制。患：获取慢性HCV感染6例（4例为HLA—A2＋）和急性丙肝感染1例（HLA—A2＋）静脉血。方法：扩增血清NS3／4A基因片断，克隆入真核生物表达质粒，然后测序并表达。应用人全血CTL和遗传免疫的HLA—A2转基因小鼠CTL，来确定在HLA—A2限制性NS3表位处CTL识别逃逸的突变是自然发生的还是人工诱导的。同时应用HCV复制子来检测逃逸突变对HCV蛋白酶活性及RNA复制的影响。     

慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的CD28表达研究

目的检测慢性乙型肝炎患者HBV特异性CTL的CD28表达情况。方法利用MHC-Ⅰ-肽五聚体（pentamer）技术结合流式多色分析技术，直接离体情况下（direct ex vivo）检测慢性乙型肝炎患者3个HLA-A2限制性的HBV表位特异性CTL表达CD28的情况。结果在22例HLA-A2^＋患者中，检测出HBcAg（18—27）特异性CTL有13例，频率为0．05％-0．16％；CD28^＋的HBcAg（18—27）特异性CTL的百分比为40％（23％-61％）。检测出HBeAg（335—343）有8例，频率为0.05％-0．24％；CD28%＋的HBeAg（335—343）特异性CTL的百分比为43％（36％-60％）。检测出HBp（575—583）特异性CTL有9例，频率为0．05％-0．19％；CD28^＋的HBpAg（575—583）特异性CTL的百分比为61％（45％-70％）。结论不同HBV抗原表位特异性CTL的CD28表达情况不同。