pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

DJ-1L166P与DJ-1M26I基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的 在细胞学水平比较DJ、DJ-1M261、DJ-1L166P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础.方法 分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500 μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M261重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166P和DJ-1M261组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166P和DJ-1M261基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166P和D J-1M261基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞(P＜0.05).结论 DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166P和DJ-1M261基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的.     

转染DJ-1和DJ-1L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的 在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究,为进一步建立DJ-1和DJ-1L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础.方法 采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段,采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变,分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1L166P重组表达载体,采用脂质体转染的方法分别将pEGFPDJ-1、DEGFP-DJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆,对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测.结果 pEGFP-DJ-1、pEGFPDJ-1L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后,分别获得6、2、9个阳性细胞克隆,RTPCR及westem blot 方法进行tau基因表述检测,结果均显示pEGFP-DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP-C3质粒转染组,而pEGFP-DJ-1L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP-C3质粒转染组,实验结果统计学分析均具有明显差异(P＜0.05).结论 在转录水平及蛋白质水平,DJ-1基因使tau基因的表达下降,而DJ-1L166P使tau基因表达上升.在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性.     

人VEGF在NIH3T3细胞中的基因转移和表达

目的研究人血管内皮细胞生长因子(human VEGF)在体外培养的小鼠成纤维细胞(NIH3T3细胞)中的基因转移及表达,为血管化组织工程、缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法应用脂质体介导的基因转移技术,将含有人VEGF165编码序列的真核表达载体pcDNA/V转染至体外培养的NIH3T3细胞系中。G418筛选出稳定表达重组质粒的细胞克隆,转接于细胞瓶中,培养72 h,同时以G418筛选的pcDNA3.1(+)阳性细胞克隆和未转染的NIH3T3细胞为阴性对照,取细胞培养上清及细胞裂解液样品进行Western blotting检测。用细胞免疫组织化学染色检测人VEGF165基因在NIH3T3细胞中的表达情况,不着色者为阴性,细胞胞质着色呈棕黄(褐)色者为阳性。结果Western blotting结果显示在转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞培养上清中,可以检测到相对分子质量为22 000的反应条带,与预计的人VEGF165单体蛋白的相对分子质量相符。细胞免疫组织化学染色检测结果显示,转染pcDNA/V质粒的NIH3T3细胞呈阳性。结论人VEGF165能够在NIH3T3细胞中有效表达,并获得了稳定表达人VEGF165基因的NIH3T3细胞株。     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

转染DJ-J和DJ-1^L166P基因的NIH3T3细胞中tau基因表达的研究

目的在转染pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P质粒的NIH3T3细胞中进行tau基因表达与DJ-1基因相关性的研究，为进一步建立DJ-1和DJ-1^L166P转基因小鼠模型及在动物整体水平研究DJ-1基因功能和帕金森病发病机制提供实验基础。方法采用RT-PCR的方法从人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）总RNA反转录获得DJ-1cDNA片段，采用突变试剂盒将第166位氨基酸突变，分别构建pEGFP-DJ-1和pEGFP-DJ-1^L166P重组表达载体，采用脂质体转染的方法分别将pEGFP-DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP-C3质粒转染NIH3T3细胞并用G418压力筛选稳定克隆，对获得的三种转染细胞在转录水平和蛋白质水平进行tau基因表达的检测。结果pEGFP—DJ-1、pEGFP-DJ-1^L166P、pEGFP—C3质粒转染NIH3T3细胞G418筛选后，分别获得6、2、9个阳性细胞克隆，RT—PCR及western blot方法进行tau基因表达检测，结果均显示pEGFP—DJ-1质粒转染组tau表达低于pEGFP—C3质粒转染组，而pEGFP—DJ-1^L166P质粒转染组tau表达则高于pEGFP—C3质粒转染组，实验结果统计学分析均具有明显差异（P〈0．05）。结论在转录水平及蛋白质水平，DJ-1基因使tau基因的表达下降，而DJ-1^L166P使tau基因表达上升。在NIH3T3细胞中tau基因表达与DJ-1基因具有一定的相关性。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

人肽脱甲酰基酶基因真核表达载体的构建及在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建人肽脱甲酰基酶(HsPDF)基因的真核表达载体并转染NIH3T3细胞,研究HsPDF基因在真核细胞中的表达及功能.方法:通过RT-PCR从人宫颈癌细胞系HeLa中扩增获得HsPDF基因,克隆到真核表达栽体pcDNA3.1(一),利用阳离子脂质体转染NIH3T3细胞,G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达载体peDNA3.1(一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明显的生物学功能,为深入研究奠定了基础. G418筛选建立稳定表达细胞系;RT-PCR检测转染后HsPDF基因的mRNA转录水平;MTT法测定转染后细胞增殖能力的变化;苏木精-伊红(HE)染色观察HsPDF对NIH3T3细胞形态的影响.结果:成功构建重组表达裁体peDNA3.1 一)-HsPDF.该载体被转染入NIH3T3细胞后,外源HsPDF基因获得了有效的转录与稳定表达.HsPDF显著促进NIH3T3细胞的增殖,并使细胞呈现出一定的恶变特征.结论:HsPDF基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达并表现出明     

人CD40L真核表达载体构建及其在NIH3T3细胞膜上的表达

目的：扩增人CD40L基因并在细胞膜上表达,建立一种不需蛋白纯化获得人CD40L的简单方法,为进一步研究其在肿瘤治疗中的作用及机制奠定基础。方法：利用梯度RT-PCR从Jurkat细胞中扩增CD40L基因,测序证明序列正确后构建pcDNA3.1-40L真核表达载体,转染NIH3T3细胞,流式细胞仪检测目的基因的表达。结果：从Jurkat细胞内成功扩增人CD40L基因,筛选到一个序列无误的克隆;成功构建pcDNA3.1-40L真核表达载体;经转染NIH3T3细胞和G418初步筛选,流式细胞检测证明约41％的NIH3T3细胞膜上有CD40L基因表达。结论：利用RT-PCR技术可以从Jurkat细胞内扩增CD40L基因,利用pcDNA3.1表达载体可以实现人CD40L基因在NIH3T3细胞膜上的表达。     

大鼠干扰素诱导蛋白-10的体外表达和鉴定

目的 构建大鼠干扰素诱导蛋白-10(IP-10)真核表达载体,在NIH3T3细胞中表达重组载体pcDNA3.1(+)-IP-10,并对其表达产物进行鉴定.方法 通过PCR扩增IP-10基因片段,通过酶切和连接反应,构建IP-10的真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实构建成功后,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,免疫荧光技术检测pcDNA3.1(+)-IP-10在NIH3T3细胞的表达情况.转染的Nm3T3细胞通过G418筛选出稳定表达的细胞克隆,Western Blotting鉴定IP-10蛋白在细胞培养上清的表达情况.结果 酶切分析、PCR及DNA序列测定证实,IP-10基因被成功克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),免疫荧光技术检测证实重组载体可在NIH3T3细胞表达.Western Blotting结果显示细胞培养上清有IP-10蛋白表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-IP-10,为进一步研究其对Th1型自身免疫性疾病的治疗效果奠定基础.     

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

  目的 探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法 共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。     

caspase-3在骨肉瘤中表达的研究

应用SP免疫组织化学方法分别检测caspase-3在38例骨肉瘤及20例骨软骨瘤中的表达。caspase-3在骨肉瘤中表达阳性率为52．6％，骨软骨瘤中为85．0％，差异显著（P〈0．05）。骨肉瘤组织中caspase-3的表达降低与骨肉瘤的发生有关。     

哺乳动物细胞CDK3系列表达载体的构建与表达

目的：构建一系列细胞周期蛋白依赖激酶3（CDK3）在哺乳动物细胞的表达载体,并在真核细胞NIH3T3中进行初步表达。方法：从食管癌细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增CDK3编码区,然后将PCR产物克隆到T载体;扩增后的CDK3片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP等4种哺乳动物表达载体;将获得的表达载体转染小鼠成纤维细胞NIH3T3,并用蛋白免疫印迹法进行初步的CDK3表达分析。结果：PCR扩增获得约900 bp目的片段,经T载体克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK3基因序列,全长915 bp;CDK3目的片段分别亚克隆入pcDNA3-4、pNTAP和pEGFP载体,获得相应表达载体;运用构建的表达载体,可以在真核细胞中表达出CDK3蛋白。结论：成功构建了CDK3系列哺乳动物细胞表达载体,并在NIH3T3中得到表达。     

反义四环素转录激活子表达细胞系的构建及鉴定

目的:构建反义四环素转录激活子(reverse Tc-controlled transactivator,rtTA)表达细胞系。方法:将RevTet-On基因表达系统中调控载体pRevTet-On转染NIH3T3细胞,经G418筛选及RT-PCR鉴定。结果:获得7个rtTA不同表达水平的细胞克隆。结论:成功构建rtTA表达细胞模型,为进一步研究特定外源基因的功能提供一个理想实验平台。     

改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体的构建及表达

目的 构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白.方法 采用PCR法设计和扩增改良型TAT-VP3融合基因,克隆至表达载体pThioHisA中,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS,经IPTG诱导表达,15%SDS-PAGE鉴定.结果 成功构建了改良型TAT-VP3融合基因的原核表达载体,经酶切、测序鉴定,证明构建正确.经SDS-PAGE鉴定可见相对分子质量16400的特异性目的 条带,37℃诱导8h的蛋白表达量最高,且多数以包涵体形式存在.结论 已成功构建改良型TAT-VP3融合基因原核表达载体,并表达目的 蛋白,为进一步的蛋白制备和应用研究奠定了基础.     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达,为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件.方法利用脂质体Fugene 6将TGFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞,RT-PCR、ELISA检测hTGFβ1基因的表达,并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性. 结果质粒转染3T3细胞后,hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且分泌表达的hTGFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长结论重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的：鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达，为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件。方法：利用脂质体Fugene6将GFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞，RT-PCR、ELISA检测h TGFβ1基因的表达，并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性。结果：质粒转染3T3细胞后，hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强，且分泌表达的hT GFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长。结论：重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

STAT3在皮肤黑素瘤组织中的表达及意义

目的:研究活化的STAT3(pSTAT3)蛋白和STAT3 mRNA在皮肤黑素瘤和色素痣组织中的表达及其临床意义?方法:应用免疫组织化学S-P法检测90例皮肤黑素瘤和43例皮肤色素痣组织pSTAT3,原位分子杂交技术检测同一批组织STAT3 mRNA的表达情况,分析它们与患者临床病理特征的关系?结果:皮肤黑素瘤组织pSTAT3蛋白和STAT3 mRNA表达阳性率分别为56.7%和47.8%,显著高于色素痣的阳性率20.9%和23.3%(均P < 0.01); 黑素瘤pSTAT3蛋白和STAT3 mRNA表达均与肿瘤的厚度?浸润深度和淋巴结转移呈正相关(均P < 0.05);pSTAT3蛋白和STAT3 mRNA的表达呈显著正相关(r = 0.311,P < 0.01)?结论:皮肤恶性黑素瘤STAT3表达状况与肿瘤生长?侵袭和转移呈密切相关,提示STAT3可能在黑素瘤发生发展过程中发挥了重要作用?     

galectin-3在子宫内膜病变中表达的研究

目的本研究检测半乳糖凝集素家族中galectin-3在正常增生期、复杂增生、不典型增生子宫内膜及子宫内膜腺癌组织中的表达情况,探讨其与子宫内膜腺癌的发生、发展的关系。方法采用S-P染色法,对10例正常增生期子宫内膜组织(NE),9例子宫内膜复杂增生组织(CH)、14例子宫内膜不典型增生组织(AH)及65例子宫内膜腺癌组织(EC)中的galectin-3表达进行检测。结果galectin-3在正常增生期、复杂增生、不典型增生子宫内膜及子宫内膜腺癌中的阳性表达率分别为3/10,1/3,78.57%和87.69%。galectin-3的表达从正常增生期子宫内膜到子宫内膜腺癌的发展过程中逐渐增高。EC组及AH组表达明显高于NE组及CH组(P<0.05)。galectin-3的表达与肿瘤的组织分化相关,低分化与高分化腺癌比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论galectin-3与子宫内膜腺癌的发生及肿瘤的病理学行为相关,过度表达提示预后不良。     

MMP-3在翼状胬肉中的表达

目的研究MMP-3在翼状胬肉发生发展中的作用及其相关性，并初步探讨其临床意义。方法应用免疫组织化学S-P法检测50例翼状胬肉组织和10例正常结膜组织中MMP-3的表达，并分析其与翼状胬肉临床病理参数间的关系。结果MMP-3在10例正常结膜组织中未见阳性表达，50例翼状胬肉组织中阳性～强阳性表达39例，阳性率78％，与正常结膜组织间有显著差异（P〈0．01）。MMP-3在翼状胬肉组织的进展期、静止期和复发性组织的表达有明显差异（P〈0．05）。不同职业患者的MMP-3表达有明显差异，其中户外工作者MMP-3的表达高于户内工作者（P〈0．05）。不同年龄组、不同性别组的MMP-3表达均无统计学差异（P〉0．05）。结论MMP-3在翼状胬肉中表达的程度与其临床分期及患者的职业类型有关，但与患者的性别、年龄无显著相关性。MMP-3活性表达升高可能与翼状胬肉的发生发展有关。