成肌细胞与雪旺细胞混合移植治疗肌营养不良的初步研究

目的 观察成肌细胞与雪旺细胞局部混合移植治疗Duchenne型肌营养不良症(DMD)模型鼠(mdx鼠)后抗肌萎缩蛋白(dys)的表达及成肌细胞与宿主的融合情况.方法 成肌细胞和雪旺细胞培养、纯化、鉴定后,将其按比例(10 :1)混合注射到mdx鼠的左侧腓肠肌内(混合移植组),同时设单纯移植组(仅注射成肌细胞),两组右侧...     

骨髓干细胞移植后mdx鼠抗肌萎缩蛋白的表达

目的研究骨髓干细胞移植治疗Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)后抗肌萎缩蛋白表达的动态变化。方法取6~8周龄C57BL/6鼠骨髓干细胞,以2×107个/只干细胞尾静脉移植到经7Gyγ射线预处理后的7~9周龄mdx鼠体内,分别于移植后5、8、12、16周应用免疫荧光、逆转录-聚合酶链反应、Western blot检测腓肠肌抗肌萎缩蛋白的表达情况。结果经γ射线放疗预处理的mdx鼠,在尾静脉移植骨髓干细胞5周后可见抗肌萎缩蛋白少量表达,随移植时间延长表达逐渐增多,16周时肌纤维抗肌萎缩蛋白的表达为12%,并可见肌细胞核中移现象较同龄mdx鼠对照组减少,边居增多。结论同种异体骨髓干细胞移植治疗mdx鼠后,骨髓干细胞通过血液循环趋向病变肌组织,并分化为肌细胞表达抗肌萎缩蛋白。随移植时间延长表达增多,提示骨髓干细胞移植可长久持续参与受损骨骼肌的修复与再生。     

骨髓间充质干细胞移植治疗Duchenne肌营养不良模型鼠的实验研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)移植治疗Duchenne肌营养不良模型鼠的可能性。方法 分离培养正常小鼠MSC局部肌肉注射移植入Duchenne肌营养不良模型鼠mdx鼠，数周后观察dystrophin蛋白表达变化。结果 MSC移植后mdx鼠dystrophin蛋白阳性表达肌纤维增加明显。结论 在mdx鼠体内MSC可分化为骨骼肌细胞。局部细胞移植治疗mdx鼠有一定效果。     

骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗对Duchenne肌营养不良(DMD)模型鼠mdx鼠病态肌肉的影响.方法 分离培养正常小鼠MSCs,局部肌肉注射移植入DMD型模型鼠mdx鼠肌肉,16周后观察mdx鼠肌肉肌力、肌肉病理学改变及dystrophin蛋白表达变化.结果 MSCs移植16周后mdx鼠肌纤维dystrophin蛋白表达增加,肌力好转,核中移明显改善.结论 MSCs移植可缓解mdx鼠肌肉病理改变,但移植效率的提高需要进一步研究.     

Duchenne肌营养不良模型鼠肌肉内移植小鼠胚胎干细胞后分化潜能的初步研究

目的 研究Duchenne肌营养不良模型鼠(mdx鼠)局部肌肉内鼠胚胎干细胞(ESCs)移植治疗后,ESCs的分化、肌肉病理改变及dystrophin蛋白表达变化.方法 eGFP标记的ESCs局部肌肉注射移植入mdx鼠,4周后观察核内移及dystrophin蛋白表达变化.结果 移植后4周mdx鼠核内移改善不明显,dystrophin蛋白阳性表达及肌纤维增加均不明显.结论 局部肌肉内胚胎干细胞移植治疗mdx鼠效果不明显.胚胎干细胞移植后分化为骨骼肌细胞的比例低.     

亚致死量放疗对Duchenne型肌营养不良鼠骨髓干细胞移植的影响

[目的]研究7 Gy γ射线放疗对Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)骨髓干细胞移植的效果。[方法]获取4~5周昆明鼠的骨髓干细胞,体外培养3 d,移植给7 Gy剂量放疗的7~8周的mdx鼠。22只7 Gy剂量放疗的肌营养不良鼠鼠,随机分为A、B、C、D 4组;A、B、C每组6只,静脉移植骨髓干细胞数为A组:1.2×106/只、B组4.8×106/只、C组1.2×107/只。D组4只作空白移植对照。观察受体鼠存活率,临床监测移植物抗宿主病(GVHD)情况;移植12周后,检测受体鼠肌组织抗肌萎缩蛋白表达情况。[结果]移植3个月后,22只实验鼠全部存活,18只移植鼠有近9％肌纤维表达dystrophin蛋白。[结论]移植前给予7 Gy γ射线放疗照射mdx鼠,部分破坏受体骨髓造血系统后,静脉注射移植同种、非同系鼠的骨髓干细胞,3个月之后,受照射鼠实现了100％存活;且移植鼠均有抗肌萎缩蛋白表达。     

逆转录病毒介导的人抗肌萎缩蛋白小基因在mdx鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建含有人抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转移的假肥大型肌营养不良模型小鼠(mdx)骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法构建含有抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PA317,制备含有目的基因的重组逆转录病毒并感染mdx鼠的MSCs,利用免疫荧光、RT-PCR法检测目的基因的表达。结果成功构建了抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体。含抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒感染mdx鼠MSCs后48h,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现319bp DNA片断;免疫荧光检测显示感染组mdx鼠MSCs中可见红色颗粒,深浅不一。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将抗肌萎缩蛋白小基因转移至mdx鼠MSCs并表达。     

抗肌萎缩蛋白小基因对Duchenne肌营养不良病理改变的治疗作用

目的　探讨Duchenne肌营养不良 (DMD)的病理变化和治疗方法。方法　采用重组腺相关病毒载体 (rAAV)介导的人抗肌萎缩蛋白小基因 (SMCKA3999)观察DMD的病理改变和治疗作用。将抗肌萎缩蛋白小基因SMCKA3999克隆至rAAV并包装成rAAVSMCKA3999病毒 ,将 5× 10 9病毒颗粒分多点注射于DMD模型鼠mdx腓肠肌 ,4个月后取局部肌组织 ,分别采用免疫荧光、埃文斯氏蓝染料、电镜等方法 ,观察rAAVSMCKA3999对DMD病理改变的治疗作用。结果　rAAVSMCKA3999有效稳定表达并使肌膜缺失的抗肌萎缩蛋白恢复 ,明显改善DMD肌肉病理改变。结论　rAAVSMCKA3999能显著改善mdx小鼠骨骼肌病理变化 ,有希望成为Duchenne肌营养不良有效的生物治疗药物     

异体骨髓干细胞移植后假肥大型肌营养不良症模型鼠膈肌dystrophin表达及病理改变

目的探讨骨髓干细胞移植对假肥大型肌营养不良症(DMD)模型鼠-mdx鼠膈肌的治疗效果。方法取雄性SD大鼠骨髓干细胞经尾静脉植入放疗处理后的8周龄雌性mdx鼠(n=18)。于移植后4、8、12周各取6只mdx鼠的膈肌行 HE染色、抗肌萎缩蛋白(dystrophin)免疫荧光检测以及dystrophin mRNA的RT-PCR分析,同时用正常C57鼠及放疗而未移植的mdx鼠作为对照,另进行PCR反应检测实验鼠膈肌内Sry(Y染色体的性别决定区)基因。结果移植后mdx 鼠膈肌间质内炎性细胞浸润较放疗而未移植mdx鼠有所减少;移植后核中心移位纤维比例[移植后4、8、12周分别为 (15．58±0．91)％、(12．50±1．87)％、(10．17％±1．17)％]较未移植mdx鼠(19．5±1．87)％显著减少。移植后dystrophin免疫荧光阳性细胞比例[移植后4、8、12周分别为(1．00±0．32)％、(6．00±1．05)％、(11．92±1．11％)]较未移植mdx鼠(O．17±0．41)％显著增加。RT-PCR结果显示C57鼠膈肌的dystrophin mRNA相对含量(0．63±0．04)最高;而未移植mdx鼠的膈肌中未检测到dystrophin mRNA;移植后的mdx鼠膈肌中mRNA的表达水平(移植后4、8、12周分别为0．19±0．05、0．26±0.06、0．36± 0．04)随时间推移逐渐增高;移植后各时间点mdx鼠膈肌Sry基因均为阳性。结论骨髓干细胞系统移植mdx鼠可以恢复部分膈肌的dystrophin表达,改善膈肌的病理,骨髓干细胞移植有希望成为全身治疗DMD的有效方法。     

建立Duchenne型肌营养不良鼠的骨髓移植模型

【目的】建立Duchenne型肌营养不良鼠(mdx鼠)的骨髓移植模型,摸索有效的放疗剂量。【方法】用体外培养的不同数量的C57BL/6雄鼠的骨髓细胞、骨髓基质细胞、骨髓悬浮细胞,用不同方法移植给不同剂量放疗后的mdx鼠,观察受体鼠的存活率及存活时间,并对死亡鼠作GVHD(移植物抗宿主病)的病理学检测。【结果】16只mdx鼠移植前3d12Gyγ射线照射,在移植后7d内全部死亡,且注射细胞数较多者,存活时间相对较长;8只经6Gyγ射线照射的mdx鼠,移植后60d,存活4只,其中1例经腹腔注射骨髓细胞、1例肌肉局部注射骨髓细胞,移植后7d内死亡;而8Gyγ射线照射的14只mdx鼠,移植后60d10例存活,4例死亡。【结论】本实验条件下,移植前8Gyγ射线放疗较合理,在有效剂量放疗破坏受体骨髓造血系统后,静脉注射移植同种鼠的骨髓细胞、基质细胞、悬浮细胞,mdx鼠存活率较高,且移植细胞数量以1×10     

己糖对杜兴肌肉萎缩症核酸药物Pip5e-PMO跳读活性研究

目的:在杜兴肌肉萎缩症模型上探究己糖混合物对核酸药物Pip5e-PMO介导的外显子跳读活性的促进作用。方法:选择成年mdx小鼠为测试动物模型,通过局部肌肉和系统尾静脉注射,比较Pip5e-PMO与己糖和生理盐水联用的作用效果,利用免疫荧光（IHC）和蛋白印迹法（Western blot）检测dystrophin阳性肌纤维的数量和分布及dystrophin蛋白的表达水平;利用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测外显子跳读。结果:在局部肌肉给药试验中,己糖能够促进Pip5e-PMO诱导dystrophin蛋白表达水平（P<0.05）。在系统试验中,对己糖和生理盐水组比较发现:按15 mg/kg的剂量单次系统尾静脉注射Pip5e-PMO,骨骼肌中dystrophin蛋白表达恢复至正常水平的50%;在心脏中,也检测到明显的dystrophin恢复表达和外显子跳读。但两组无显著性差别（P>0.05）。结论: Pip5e-PMO可诱导有效的外显子跳读和dystrophin蛋白表达,但己糖对其促进效果有限。     

3H-TdR标记人骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞移植mdx鼠能否修复骨骼肌肌膜病变及干细胞在其体内的分布特点.方法 用氚-脱氧胸腺嘧啶(3H-TdR)标记人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs),以每只鼠干细胞1×10⁷/0.3 ml经尾静脉注入18只免疫抑制的mdx鼠(8～10周龄).于移植后24 h、48 h、2周、1月、2月、4月处死鼠,分别测定各组织器官的放射活性;用免疫荧光法检测骨骼肌肌膜营养障碍基因(dystrophin,Dys)表达情况.结果 移植后1月,多数组织、器官放射活性显著高于对照组,其中以骨髓、肝、脾放射活性增高更为明显.大多数组织器官放射活性随时间推移逐渐下降,而骨骼肌放射活性的从2周时开始逐渐升高,于1月时达到高峰(27.6±3.3 Bq/mg湿重).1月之后,骨髓、骨骼肌放射活性仍保持较高水平.免疫荧光显示移植后24 h、48 h、2周骨骼肌Dys免疫荧光呈阴性,1月后呈阳性,1月、2月、4月阳性率分别为:6.6%、8.4%、8.9%.结论 hBM-MSCs能植入mdx鼠体内,并融合、分化为骨骼肌,部分修复骨骼肌肌膜病变;hBM-MSCs移植入mdx鼠后早期主要分布在骨髓、肝、脾,后期主要分布在骨髓、骨骼肌.     

^3H-TdR标记人骨髓间充质干细胞移植治疗mdx鼠的实验研究

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of using human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBM- MSCs) for repairing the skeletal muscle sarcolemma lesions in mdx mice and characterize the distribution of the transplanted hBM-MSCs. METHODS: Eighteen 8- to 10-week-old immunosuppressed mdx mice received transplantation with 1x10(7) of hBM-MSCs (the fifth passage) with 3H-thymidine (3H-TdR) labeling by injection of the cells into the tail vein. The mice were killed at 24 h, 48 h, 2 weeks, and 1, 2 and 4 months after the transplantation, respectively, to measure the radioactivity in the tissues and organs. Dystrophin expression on the sarcolemma was detected by immunofluorescence analysis. RESULTS: One month after transplantation, the mice with cell transplantation showed greater radioactivity in most of the tissues and organs than the control mice, especially in the bone marrow, liver and spleen. The radioactivity was then gradually lowered but in the skeletal muscle, the radioactivity increased progressively since 2 weeks after transplantation, reaching the peak of 27.65+/-3.53 Bq/mg at 1 month. Compared with that in the control mice, the radioactivity in the bone marrow and skeletal muscle was persistently higher in mice with cell transplantation 1 month after transplantation. No dystrophin-positive cells were found in the mdx mice at 2 weeks but detected at 1 month. The percentage of dystrophin-positive fibers in each section ranged from a 6.6% (1 month) to 8.9% (4 months). CONCLUSIONS: hBM-MSCs engrafted in immunosuppressed mdx mice may differentiate into skeletal muscle cells to repair the pathological lesion of the skeletal muscle sarcolemma. The hBM-MSCs reside mainly in the bone marrow, liver and spleen in the early stage following transplantation, homing into the bone marrow and skeletal muscle later.     

B族维生素对肌肉萎缩小鼠PMO运输效率的影响

目的:探究B族维生素对反义寡核苷酸药物磷酸二胺吗啉代寡核苷酸（PMO）在DMD治疗中运输效率的影响以及药物安全性评价。方法:通过对成年的杜兴肌肉萎缩症（DMD）模型mdx小鼠胫骨前肌分别局部注射PMO和各种维生素的混合液,利用免疫荧光（IF）和Western印迹检测dystrophin蛋白表达情况,评估各维生素对PMO作用效果的影响;通过尾静脉注射PMO和维生素B12的混合液,相同方法检测维生素B12对PMO治疗效果的影响,同时利用苏木素-伊红组织染色（HE）技术检测组织病理情况,评估维生素B12联合PMO治疗的安全性。结果:在mdx小鼠局部给药实验中,比较不同的B族维生素对PMO药效影响时,发现维生素B12对PMO的促进效果最佳（t=8.015,P＜0.01）;随后选择维生素B12与PMO混合对mdx小鼠进行系统治疗时,相比于PMO生理盐水组,发现维生素B12能够在胫骨前肌（t=9.631,P＜0.01）和股四头肌（t=8.452,P＜0.01）上明显提高PMO的系统治疗效果,同时对mdx小鼠不产生肌肉不良反应。结论:维生素B12作为营养补充剂能够显著提高PMO在mdx小鼠上的局部治疗效果,但系统治疗效果有限,且对小鼠肌肉组织无损伤。     

不同方式递送质粒DNA诱导体内表达效果的实验研究

目的比较不同途径递送质粒DNA至Balb／c小鼠体内所诱导的报告基因表达效果。方法将编码荧光素酶（1uc3蛋白的重组质粒（pGL-3-CMV）或空载体质粒pGL-3-basic以肌肉注射或电脉冲方法将10μg或100μg上述质粒注入小鼠股四头肌,基因枪法以三枪接种质粒于小鼠腹部（2μg质粒DNA／4．5Mpa／枪）。于质粒注入后24～144h,检测小鼠体内的荧光素酶活性。结果肌肉注射10μg的小鼠未检测到荧光素酶的表达;肌肉注射100μg、电脉冲法递送10μg和100μg质粒的小鼠,接种后48h体内荧光素酶活性达到峰值,递送100μg的小鼠体内表达量明显高于10μg的小鼠。基因枪免疫小鼠在接种24h达到峰值。结论电脉冲和基因枪介导的基因递送方式基因表达水平远远高于传统注射方法,是基因疫苗免疫递送的可靠方法。     

人骨髓间充质干细胞在mdx鼠体内的动态分布

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)在mdx鼠体内的动态分布特点。方法用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记hBM-MSCs,将1×107个干细胞(0·3ml)经尾静脉注入免疫抑制的mdx鼠(8~10周龄)体内。于移植后48h、2、4、8、12、16、20、24周处死鼠,用免疫荧光法检测各组织器官的BrdU阳性细胞核数、骨骼肌人细胞核(Hu)及人抗肌萎缩蛋白(Dys)的表达,RT-PCR检测人Dys mRNA的表达。结果移植后4周内,BrdU阳性细胞核可见于多数组织、器官,其中以骨髓、肝、肺较多;肝、肺BrdU阳性细胞核数4周后逐渐下降;移植后48h骨髓BrdU阳性细胞核数较多,2周最多,16周后仍维持较高水平;4周后骨骼肌的BrdU阳性细胞核数逐渐增加。移植后2周骨骼肌检测到少量人特异性抗核抗体(anti-Hu)阳性细胞核,4周后在骨骼肌肌膜可见少量人特异性Dys阳性细胞,8周后有Dys mRNA的表达;随着移植时间的延长,anti-Hu抗体阳性细胞核数和Dys阳性细胞比例逐渐增高,DysmR-NA的表达逐渐增强。结论hBM-MSCs移植mdx鼠后早期(2~4周)主要分布在骨髓、肝、肺,后期(4周后)主要分布在骨髓、骨骼肌。     

Construction of a recombinant plasmid harbouring the rhoptry protein 1 gene of Toxoplasma gondii and preliminary observations on DNA immunity

Objective To observe the immune responses elicited in BALB/c mice by a DNA vaccine. A ge ne encoding rhoptry protein 1 (ROP1) from Toxoplasma gondii (T. gondii) was cloned into vector pcDNA3.Methods Amplifyied gene fragments coding for ROP1 from the genomic DNA of T.gondii ZS2 were inserted into cloning vector, pUC18, and sub-cloned into pcDNA3. Mice wer e injected at a dosage of 100 μg recombinant plasmid DNA by intramuscular inje ction and boosted after 2 weeks. pcDNA3 and normal saline were used as control . 30, 50 and 70 days after the second immunization, NK cell activity, T lympho cyte proliferation and sub-clusters and serum IgG antibody were assayed.Results The specific gene fragment coding for ROP1 was amplified and a pcROP1 recombinan t was constructed. At 30 days after immunization, the spleens of the mice were obviously enlarged evidently. NKC activity and the proliferation of spleen T ly mphocytes seen on MTT assay were higher in pcROP1 group than in the controls. T he number of CD4(+) T cells exhibited no obvious increase compared with that of the control, but CD8(+) T cells were obviously increased (P&lt;0.05). At 90 d ays after vaccination, the titer of IgG antibody in the serum of vaccinated mice was positive (1∶100).Conclusion pcROP1 was constructed and it could elicit both cellular and humoral immune r esponses in immunized mice.     

空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性研究

目的探讨空肠弯曲菌PEB1重组蛋白的免疫原性及对机体的保护作用。方法以不同剂量的含弗氏佐剂的纯化PEB1重组蛋白为疫苗,分别经皮下注射和肌肉注射的方法免疫Balb/C小鼠,ELISA法测定血清中特异性抗体的含量,MTT法测定细胞增殖效应。CJ菌液攻击实验,观察攻击后小鼠的精神状态、病死情况,并做血液、肠道分泌液细菌培养。结果用PEB1重组蛋白免疫Balb/C小鼠,可诱导出高滴度的特异性抗体,能有效地刺激淋巴细胞增殖,加入刺激原的各实验组SI值均较对照组显著增高。结论PEB1重组蛋白免疫接种后可诱导出高滴度特异性抗体和致敏淋巴细胞,能有效保护小鼠免受大剂量空肠弯曲菌的攻击,是一种比较理想的基因工程亚单位疫苗候选抗原。细菌攻击实验结果表明,PEB1基因工程亚单位疫苗能使实验动物产生有效的免疫保护力,明显降低动物的患病率和病死率,并能有效地降低血液和肠道分泌液的细菌含量。