AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞

目的 探讨AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的最佳条件.方法 胶原酶消化法获得人ADSCs并行原代培养,流式细胞仪鉴定其表面标记;AdMaxTM重组腺病毒载体以梯度感染复数值(MOI)(10、50、100、200、400、800)转染人ADSCs,分别于转染后24、48、72、96 h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,KS400型图像分析仪测定转染效率.结果 当MOI为400时可获得较佳的转染效率,GFP阳性细胞数量达到峰值,转染率达到91.25%.空载体转染人ADSCs的效率与转染时间无显著相关性.结论 AdMaxTM重组腺病毒是转染人ADSCs的较理想载体.通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高转染效率.     

AdMax~(TM)重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞

目的 探讨AdMaxTM重组腺病毒载体转染人脂肪间充质干细胞(ADSCs)的最佳条件.方法 胶原酶消化法获得人ADSCs并行原代培养,流式细胞仪鉴定其表面标记;AdMaxTM重组腺病毒载体以梯度感染复数值(MOI)(10、50、100、200、400、800)转染人ADSCs,分别于转染后24、48、72、96 h,荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)表达,KS400型图像分析仪测定转染效率.结果 当MOI为400时可获得较佳的转染效率,GFP阳性细胞数量达到峰值,转染率达到91.25%.空载体转染人ADSCs的效率与转染时间无显著相关性.结论 AdMaxTM重组腺病毒是转染人ADSCs的较理想载体.通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄入,从而提高转染效率.     

重组腺病毒Ad-DDAH2转染大鼠脂肪干细胞的可行性

目的 探讨腺病毒载体(Ad-DDAH2)转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的可行性。方法 构建Ad-DDAH2-GFP质粒。原代培养大鼠ADSCs,流式细胞术检测免疫表型CD29、CD45、CD90表达情况。以不同滴度的Ad-DDAH2-GFP转染ADSCs,用荧光显微镜计数转染效率及细胞形态。通过RT-PCR及Western Blot检测DDAH2在ADSCs中的表达情况。结果 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建、包装成功,且病毒滴度达到2E+10PFU/ML。第4代ADSCs生长曲线呈现“S”形。细胞免疫表型CD29、CD90阳性率分别为(95.83±0.53)%、(91.32±0.27)%, CD45阳性率为(1.59±0.06)%,符合ADSCs免疫表型特征。当病毒感染复数值为80、100时,转染效率均可达到90%以上。但病毒感染复数值为100时,ADSCs出现明显细胞病理现象,因此病毒感染复数值为80被视为最佳感染复数,RT-PCR及Western Blot鉴定可见阳性扩增条带。结论 Ad-DDAH2-GFP重组腺病毒载体构建成功,可以高效转染大鼠ADSCs。DDAH2在mRNA及蛋白稳定长期表达,为后续体内实验奠定了实验基础。     

超声联合微泡造影剂携p53基因转染宫颈癌HeLa细胞的实验研究

目的 探讨超声联合微泡造影剂介导野生型p53(wtp53)基因转染宫颈癌HeLa细胞的可行性、效率性及作用效果.方法 以前期实验所筛选的超声辐照参数(300 kHz,0.5 W/cm~2,30 s)为实验条件,将HeLa细胞分为质粒组(A组)、质粒+超卢组(B组)、质粒+超声+微泡组(C组)、质粒+脂质体组(D组)、空白对照组(E组),分别进行处理.转染24～48 h后,收集各组细胞,荧光显微镜观察细胞基因转染效率、RT-PCR检测p53 mRNA表达,流式细胞仪检测细胞周期,M1Tr检测细胞增殖抑制情况.结果 荧光显微镜下见C、D组均有较多绿色荧光蛋白表达的细胞(转染率分别为14.15%和10.86%),B组仅有极少的荧光细胞(0.81%);A组和E组无荧光表达;RT-PCR结果 显示,C组和D组均可见特异性p53电泳条带,C组的电泳条带的光密度比值高于D组(P<0.05);流式细胞仪测细胞周期展示,转染野生型p53基因能使细胞周期出现明显的G_1期阻滞,C、D组与E组相比差异有显著性(P<0.05);MTT测定结果 显示c组细胞生长明显受抑,且随时间的延长,抑制程度逐渐增强.结论 适当浓度的微泡和优化的超声辐照条件可增强基因转染效率,野生型p53基阒能使HeLa细胞产生G_1期阻滞,抑制宫颈癌细胞生长.     

超声微泡促腺病毒载体转染MDR1基因效率的体外实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂在体外促进腺病毒载体介导的MDRl基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,并初步探讨其安全性.方法 根据是否加入超声微泡造影剂和超声辐照将分选的兔骨髓单个核细胞分为常规培养组(A)、腺病毒MDRl基因转染组(B)、腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(C)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染组(D)、微泡造影剂+腺病毒MDRl基因转染+超声辐照组(E).收集各组细胞,应用RT-PCR法、流式细胞技术等分别从基因、功能及细胞生物学特性等方面检测外源性MDR1基因在骨髓单个核细胞内的功能性表达及安全性.结果 收获高滴度的Ad5-MDR1腺病毒载体并成功制备腺病毒微泡造影剂;RT-PCR结果 显示,除A组外其余4组在194 bp处均观察到特异性MDR1电泳条带,证实外源性MDR1基因通过腺病毒载体整合到细胞基因组中,且E组MDR1电泳条带的光密度比值明显高于B、C、D组(P<0.05);柔红霉素排出实验证实外源性MDR1基因表达产物P-gP有药物外排泵功能,且E组P-gp阳性率最高(P<0.05),而柔红霉素阳性率显著降低;一定强度的超声辐照及微泡造影剂对骨髓单个核细胞的细胞周期无明显影响.结论 低频超声波击碎微泡造影剂,能促进以腺病毒为载体介导的外源性MDR1基因转染兔骨髓单个核细胞的效率,且安全可行.     

微泡造影剂结合超声介导一氧化氮合成酶基因转染血管平滑肌细胞

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因转染体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)的可行性.方法 实验分为A、B、C、D、E5组,分别为空白对照组、单纯质粒浸泡组、质粒+微泡造影剂组、质粒+超声辐照组、质粒+超声辐照+造影剂组.用重组真核表达载体pcDNA3.1- eNOS经微泡造影剂及超声辐照介导转染体外培养的大鼠VSMCs,辐照条件为超声探头频率为10 MHz,机械指数为1.9,辐照时间为10 min,重组真核细胞表达载体pcDNA3.1-eNOS 5μg/mL.辐照48 h后,采用RT-PCR、Western blot及免疫组化检测VSMCs内eNOSmRNA和蛋白的表达.结果 RT -PCR检测E组eNOS mRNA的表达最显著,积分吸光度(IA)比值为(91.11±3.41)％,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(26.10±1.32)％、(31.42±2.43)％、(35.05±2.25)％,与E组相比均P＜0.05.蛋白印迹分析eNOS蛋白表达,A组有极少量表达,B、C、D组也有少量表达,IA比值分别为(22.12±1.33)％、(25.42±2.41)％、(33.11±3.11)％,而E组表达最明显,IA比值为(84.22±9.22)％,与各组相比均P＜0.05.结论 超声辐照结合微泡造影剂能显著提高eNOS基因在VSMCs的转染效率,提高细胞内一氧化氮合成酶的表达.     

动态压力联合胰岛素样生长因子1基因转染促进兔脂肪间充质干细胞低氧诱导因子1α的表达

目的 初步探讨兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)HIF-1α促进ADSCs成软骨分化的作用机制.方法 观察动态压力联合低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染对兔脂肪间充质干细胞(ADSCs)HIF-1表达的影响.采用I型胶原酶消化法,分离、纯化、扩增兔ADSCs.构建稳定表达pcDNA3.1-IGF-1的细胞株,以5×107/ml的密度接种于壳聚糖/明胶复合支架材料上,分组培养:A组(空白对照组)接种未转染基因的脂肪间充质干细胞,B组(IGF-1组)接种稳定转染胰岛素样生长因子1的脂肪间充质干细胞,C组(压力组)与D组(压力+IGF-1组)分别为A、B组的细胞/支架复合物于压力型生物反应器中动态培养(2%at 0.1Hz),连续培养7 d.进行形态学观察,MrTT法绘制细胞增殖曲线,并应用Di1荧光标记观察细胞在支架上的分布情况.比较组织工程软骨中糖胺聚糖(GAG)含量和相关基因(IGF-1,HIF-1α,Ⅱ型胶原和Sox-9)相对表达的差异.结果 形态学观察,MTr,Dil荧光标记,GAG含量测定以及实时聚合酶链反应结果均显示A组＜C组＜B组＜D组.实验证实单纯基因转染组的HIF-1α、Sox-9等基因表达水平和GAG含最明显高于单纯压力组,而二者联合培养则能够获得更为显著的效果,其结果远大于二者简单的加合.结论 三维立体培养条件下,动态压力与IGF-1基因转染联合作用明显促进细胞自身分泌内源性IGF-1;IGF-1与动态压力刺激均明显上调兔ADSCs HIF-1α的表达水平,并且二者存在协同作用.HIF-1α表达上调对促进兔ADSCs成软骨分化、增殖以及分泌细胞外基质均具有重要作用.     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

Sox-9和igf-1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的 探讨应用Sox-9和igf-1基因转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)后,目的 基因和蛋白分泌情况及向软骨细胞的分化效果.方法 扩增、提取质粒pcDNA3.1-igf-1、pcDNA3.1-Sox-9,分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,将Sox-9和igf-1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染Sox-9组(C组)、转染igf-1组(D组)、Sox-9与igf-1共转染组(E组).对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达.结果 MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01).但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05).RT-PCR和Western blot检测目的 基因和蛋白的表达量,Sox-9表达以C组最多;igf-1表达以E组最多;Ⅱ型胶原表达以E组最多.结论 通过Sox-9和igf-1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向.     

腺病毒载体介导的VEGF基因转染对C17.2神经干细胞凋亡的影响

目的探讨重组腺病毒介导血管内皮生长因子(VEGF)165基因治疗对缺氧状态下对神经干细胞凋亡的作用。方法体外培养C17.2神经干细胞,建立神经干细胞缺氧模型。将携带人类VEGF基因的重组腺病毒感染C17.2神经干细胞,Western-blotting分析VEGF蛋白的表达,并用流式细胞术测定细胞凋亡率的变化。Hoechst33342染色荧光显微镜观察凋亡小体。结果转染pAdCMVVEGF165的C17.2神经干细胞成功表达VEGF蛋白;缺氧后神经干细胞凋亡率为(19.98±0.55)%,而转染pAdCMVVEGF165后的细胞凋亡率为(10.38±0.48)%(P<0.01),转染pAdCMVVEGF165 VEGF反义寡核脱氧核酸经干细胞凋亡率为(19.07±0.64)%,与对照组无显著差异(P>0.05)。结论腺病毒介导的VEGF165基因能高效表达VEGF;外源性VEGF对C17.2神经干细胞具有抗凋亡作用,能够提高C17.2神经干细胞对缺氧的耐受性,有利于神经干细胞的生存。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值

目的 探讨降钙素原变化率的测定对细菌性肺炎的评估价值.方法 选取住院治疗的细菌性肺炎患者72例,根据治疗效果分为治疗有效组(有效组)47例和治疗无效组(无效组)25例,对治疗有效组和无效组中的降钙素酶原变化及影响肺炎治疗效果的危险因素进行分析.结果 有效组治疗后3天及治疗后7天的降钙素酶原显著低于无效组的患者(P＜0.05);年龄＞65岁、心功能≥3级、COPD、糖尿病、肺部双侧受累(X线示)、菌血症、感染性休克和3天内降钙素酶原变化率＜30％是影响细菌性肺炎治疗效果的危险因素;感染性休克、肺部双侧受累、3天内降钙素酶原变化率＜30％及心功能≥3级是影响细菌性肺炎治疗效果的独立危险因素.结论 测定降钙素原变化率对细菌性肺炎的疗效评估具有重要临床意义,可在临床推广应用.     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。