原白头翁素对铜绿假单胞菌群体感应系统调控的毒力因子表达量的影响

目的 研究原白头翁素对铜绿假单胞菌（PA）的生长及群体感应系统（QS系统）调控的毒力因子表达的影响。方法 测定原白头翁素对PA的最低抑菌浓度和生长曲线,以40 μmol/L的呋喃酮C-30作为阳性对照,测定原白头翁素（40、80 μmol/L）对铜绿假单胞菌标准株PAO1生长曲线的影响以及QS系统调控的毒力因子中胞外3种毒力因子（绿脓菌素、蛋白水解酶和弹性蛋白酶）表达量的影响。结果 在实验所采用的浓度下,原白头翁素对铜绿假单胞菌的生长未表现出明显的抑制作用,但对PAO1的3种毒力因子均有抑制作用,并呈现出剂量相关性。结论 原白头翁素抗感染的机制可能是作用于铜绿假单胞菌的QS系统,抑制毒力因子表达,从而降低该菌的毒力。     

236株铜绿假单胞菌的耐药性分析

目的：测定铜绿假单胞菌对倍能等16种抗菌药物的耐药性。方法：采用VITEK－32微生物自动分析仪测定236株铜绿假单胞菌的药敏，并对其中52株菌测定了对9种抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）。结果：铜绿假单胞菌对头孢曲松、头孢噻肟、庆大霉素和哌拉西林的耐药率均超过50％，对倍能和泰能的耐药率分别为7．7％和13．5％。结论：倍能和泰能对铜绿假单胞菌的抗菌作用最强，应作为治疗重症铜绿假单胞菌的首选用药。     

铜绿假单胞菌Ⅰ类整合酶基因在生物被膜的表达

目的 研究携带Ⅰ类整合子的铜绿假单胞菌在浮游状态和生物被膜状态Ⅰ类整合酶基因(intI1) mRNA的表达水平,探讨生物被膜中整合子相关的基因转移的分子机制.方法 采用竞争RT-PCR方法定量检测intI1在两株临床分离的铜绿假单胞菌(PA10和PA39)生物被膜菌和浮游菌中mRNA的表达水平.首先用PCR方法从Ⅰ类整合子阳性铜绿假单胞菌全基因组DNA中扩增竞争体DNA (cDNA),再以cDNA为模板体外转录合成竞争体RNA (cRNA);再将不同稀释度的cRNA分别与铜绿假单胞菌的浮游菌和生物被膜菌的总RNA提取物进行竞争RT-PCR,产物经电泳分析,以已知cRNA的量确定待测样本中intI1 mRNA的表达量.结果 两株铜绿假单胞菌在其浮游状态和生物被膜状态都有intI1 mRNA表达;两菌的浮游菌和生物被膜菌intI1 mRNA表达量分别近似相等;但两菌生物被膜菌intI1 mRNA的表达量都较其浮游菌高(约15倍).结论 铜绿假单胞菌在生物被膜状态下Ⅰ类整合子intI1 mRNA的表达上调是耐药性广泛传递和多重耐药性形成的可能原因之一.     

DNase Ⅰ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响

目的研究不同浓度DNaseⅠ对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜形成及成熟生物膜的影响。方法分光光度计法检测25、50、100U／ml的DNaseⅠ对非黏液型铜绿假单胞菌PAOⅠ和黏液型铜绿假单胞菌PA17生长曲线的影响；改良平板培养法建立生物膜模型，分别在生物膜形成过程中及生物膜形成后用25、50、100U／ml的DNaseⅠ处理，扫描电镜观察PAOⅠ和PA17的生物膜形态。结果随着DNaseⅠ浓度增加，PAOⅠ和PA17的对数生长期延迟，但最终不能抑制细菌生长；25U／ml的DNaseⅠ即可抑制不同类型铜绿假单胞菌生物膜形成且分解成熟生物膜，100U／ml的DNaseⅠ可完全阻止铜绿假单胞菌生物膜形成并彻底分解成熟生物膜。结论DNaseⅠ不能直接杀灭铜绿假单胞菌，但可有效抑制铜绿假单胞菌生物膜形成并分解成熟生物膜，对非黏液型和黏液型铜绿假单胞菌生物膜的影响无明显差异，作用效果呈浓度依赖性。     

一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌的生物学特性

目的研究黏液型铜绿假单胞菌PA17中的mucA基因序列及其生物膜形成、生长速度和耐药性,并与铜绿假单胞菌标准菌株PAOI进行比较。方法采用聚合酶链反应(PCR)方法分别扩增PA17与非黏液型铜绿假单胞菌标准菌株PAOI的mucA基因,全自动荧光测序仪测序。同时用改良的平板培养法分别建立PA17和PAOI的生物膜模型,于8h、24h、3d,6d用扫描电镜检测生物膜形成情况。稀释平板计数法比较PA17和PAOI的生长曲线,国际标准琼脂平皿二倍稀释法检测常用抗生素对上述两菌株的体外抗菌活性。结果PA17mucA基因第166～333位核苷酸缺失;其生物膜形成速度及生长速度明显慢于PAOI;PA17与PAOI对常用抗生素的耐药性一致。结论发现一株含新的mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌,其生物学特性不同于以往报道的黏液型铜绿假单胞菌,可能与mucA基因新的突变有关。     

中药体外抑制铜绿假单胞菌效果观察

精选七味中药，观察不同血清型铜绿假单胸菌(PA)的最小抑菌浓度(MIC)。结果显示：中药乌梅、黄芩、黄连抑菌效果明显，MIC分别为0．97-15．62mg／ml、0．97—7．81mg／ml、15．62—62．5mg／ml。不同血清型铜绿假单胞菌对中药耐药性有差异。     

铜绿假单胞菌对环丙沙星的抗药性和耐药性机制研究

目的研究铜绿假单胞菌对环丙沙星的抗药性(resistance)和耐药性(tolerance)机制,并予以区分。方法分离养殖场和医院铜绿假单胞菌33株,用微量肉汤稀释法测定铜绿假单胞菌临床分离株对喹诺酮类抗生素的最低抑菌浓度(MIC),筛选喹诺酮抗药菌5株;体外连续培养诱导铜绿假单胞菌标准菌株P.aeruginosa ATCC27853,得到对环丙沙星和头孢噻肟的高抗药性菌株PA34。检测及分析铜绿假单胞菌喹诺酮耐药决定区(QRDR)的基因突变;荧光比色法检测不同抗药性表型的铜绿假单胞菌外排泵活性;荧光定量RT-PCR法检测铜绿假单胞菌外排泵、跨膜转运蛋白及喹诺酮靶酶编码基因的mRNA表达水平。结果 临床分离的5株喹诺酮抗药表型的铜绿假单胞菌,其外排泵活性均显著高于标准菌株(P<0.01),外排泵、喹诺酮靶位酶编码基因的mRNA的表达量上调、跨膜转运基因表达量下调,DNA旋转酶A亚基gyrA基因均发生点突变Thr-83→Ile。PA34和这5株抗药性菌株表现一致,但其MIC远高于这5株抗药性菌株,主要由于PA34除了gyrA基因发生点突变Thr-83→Ile外,parC基因发生多点突变Glu-84→Gln、Gln-91→Lys,且跨膜转运基因表达量极低。结论 在喹诺酮类抗生素选择压力下,铜绿假单胞菌能发展多种可能的机制以消除抗生素对细菌代谢的损伤,对类似gyrA、parC基因突变称为抗药性,其他生理性适应机制称为耐药性,其抗药性突变和耐药性调节共同决定了抗药性表型,但对其加以区分并分别研究,更容易集中研究单纯的抗药性突变机制,采取相应的用药措施。     

铜绿假单胞菌PA0745基因突变株的构建及鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌PA14细胞株的PA0745基因突变株,并验证其致病性.方法 采用同源重组原理构建铜绿假单胞菌PA0745基因缺失株和点突变株.利用质粒抗性和营养缺陷进行筛选,获得铜绿假单胞菌突变株E126A、E146A和△PA0745.分析突变PA0745基因后,PA14细胞株生长特性及致病性变化.结果 成功构建PA14细胞株的PA0745基因突变株E126A、E146A和APA0745.生长曲线测定结果表明,PA0745基因突变后,不影响PA14细胞株正常生长.细胞侵染实验结果显示,相较于PA14细胞株,E126A、E146A和△PA0745对RAW264.7侵染能力分别下降了29.51％、60.66％和79.34％.结论 本研究成功构建了PA14细胞株的PA0745基因突变株,并初步验证了PA0745基因的功能,这对开发抗菌药物有指导意义.     

赤丹丸与其组方药材的体外抑菌试验

目的：研究赤丹丸及其组方药材的体外抑菌作用。方法：采用液体培养基2倍稀释法测定赤丹丸及其组方药材的水提取物和乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌的体外最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。结果：赤丹丸及其组方药材的水提取物和醇提取物对白色念珠菌的抑菌作用明显弱于对其它3种菌的作用（P〈0．05），其中药材的水提取物体外抑制白色念珠菌作用相对较强（P〈0．05）；各种提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的抑菌作用也各有差异。药材水提取物对铜绿假单胞菌、白色念珠菌的抑菌作用最强（P〈0．05）；赤丹丸醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌作用最强（P〈0．05）。结论：赤丹丸及其组方药材的水提取物与醇提取物对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌均具有体外抑菌作用。     

荧光定量PCR法检测不同状态下铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达

目的检测铜绿假单胞菌工类整合酶基因（intⅠ1基因）在生物膜状态和浮游状态表达水平的差异,探讨整合子的作用机制。方法对3株Ⅰ类整合酶阳性的铜绿假单胞菌分别进行液相培养和生物膜细菌培养,常规方法提取3株细菌两种生长状态的总RNA。采用荧光定量PCR（FQ-PCR）法,以细菌的16s rRNA为内参照,分别测定菌株SW07、R07和TH12的浮游细菌和生物膜细菌intⅠ1mRNA的相对表达量,比较3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达水平。结果3株铜绿假单菌的生物膜细菌和浮游细菌都检测到intⅠ1基因的表达。3株菌在两种状态下intⅠ1mRNA的表达量不同,生物膜细菌intⅠ1基因的表达水平较高,其中菌株R07、SW07和TH12的生物膜细菌intⅠ1mRNA的表达量分别较浮游细菌高1．4、5．7和128倍。结论在生物膜状态下,铜绿假单胞菌intⅠ1基因的表达上调,本实验结果提示整合子在生物膜细菌中可进行更加活跃的基因盒捕获和积累,整合子和细菌生物膜的形成是导致细菌对抗生素耐药的重要机制。     

pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能

目的拟研究长链高丝氨酸内酯降解基因pvdQ在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。方法通过乙酸锂转化法构建CAI-4HWP1-LacZ菌株,使用X-gal平板显色法检测3-oxo-C12-HSL对白假丝酵母菌形态转换的影响;观察与铜绿假单胞菌pvdQ高表达株、野生株PAO1共同培养时,白假丝酵母菌的形态变化,了解pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能。结果 400μg 3-oxo-C12-HSL即可完全抑制白假丝酵母菌的形态转换。铜绿假单胞菌pvdQ高表达株和野生株PAO1均可抑制白假丝酵母菌菌丝形成。pvdQ高表达株对白假丝酵母菌的形态抑制作用较野生株PAO1减弱。结论铜绿假单胞菌通过分泌信号分子3-oxo-C12-HSL,可抑制白假丝酵母菌形态转换。随着pvdQ表达增加,铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌的形态抑制作用减弱,即pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中起负性调节作用。其作用机制可能与pvdQ基因对3-oxo-C12-HSL的水解作用有关。     

肽核酸体外抑制铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的研究

目的研究肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用,探讨其潜在的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的应用价值。方法采用计算机软件设计和斑点杂交联合筛选出能与铜绿假单胞菌PAO1早期生物膜形成关键基因motA mRNA结合紧密的反义寡核苷酸序列,根据其序列合成肽核酸(PNA)并连接穿膜肽(cell pene-trating peptide,CCPs)(KFF)3K形成CCPs-PNA,分别采用不同浓度的CCPs、PNA和CCPs-PNA处理铜绿假单胞菌PAO1,定量测定并用显微镜观察其对生物膜形成的抑制作用。结果 PNA和CCPs-PNA对铜绿假单胞菌PAO1生物膜的早期形成都有抑制作用,并且随着浓度的增加,其抑制作用也增加,但CCPs-PNA对生物膜形成的抑制明显优于PNA组。1、5、10μmol/L的(KFF)3K-PNA对PAO1生物膜形成的抑制率分别约为30%、50%、70%。而1μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成基本没有影响,5、10μmol/L的PNA对PAO1生物膜形成的抑制率却分别为3%和10%左右。各个浓度的CCPs对细菌生物膜的形成都没有影响。与对照组相比,CCPs-PNA处理之后的PAO1,其运动能力明显下降,PAO1处理组与对照组在运动培养基上的扩散直径之比约为3∶5。结论针对motA基因的PNA通过抑制PAO1的运动能力、降低吸附,从而对铜绿假单胞菌PA01起始阶段的生物膜形成产生抑制作用,穿膜肽(KFF)3K大大增强了此作用。推测铜绿假单胞菌的motA基因或其编码产物可能是一个良好的抗铜绿假单胞菌生物膜形成的靶点。     

pvdQ基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

目的 观察pvdQ(PA2385)基因对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响.方法 构建pvdQ基因表达质粒pME6032-pvdQ,鉴定后,采用电穿孔法将其转入PAO1野生株中,构建pvdQ高表达株.同时将空质粒pME6032采用电穿孔法转入PAO1野生株中,构建pME6032空质粒株,采用Real-time PCR检测各株...     

乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌毒力因子表达的影响

目的：研究乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌绿脓菌素、弹性蛋白酶表达的影响.方法：在泛耐药铜绿假单胞菌培养基（D600 =0.05）中分别加入乳铁蛋白多肽（LFampin、LFcin）以及乳铁蛋白多肽嵌合体（LFchimera）溶液干预,通过氯仿萃取法定量检测绿脓菌素水平,用刚果红弹性蛋白检测法检测弹性蛋白酶活性.结果：LFampin、LFcin以及LFchimer均对泛耐药铜绿假单胞菌有杀菌活性,且能显著抑制绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达,其作用与浓度呈正相关,其中,LFchimera的作用强于LFampin及LFcin,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论：乳铁蛋白多肽,尤其是乳铁蛋白多肽嵌合体对泛耐药铜绿假单胞菌具有良好的抗菌活性,能显著抑制其绿脓菌素、弹性蛋白酶的表达.     

铜绿假单胞菌的耐药特征及oprD2基因的检测

目的了解铜绿假单胞菌临床分离菌株的耐药特征及外膜通道蛋白oprD2基因的缺失情况。方法琼脂稀释法检测最低抑菌浓度（MIC）,聚合酶链反应（PCR）检测oprD2基因。结果铜绿假单胞菌检出率最高的是ICU病房和呼吸科病房,分别占50.8%和23.1%;65株铜绿假单胞菌对13种抗生素耐药率最低的是头孢哌酮/舒巴坦（30.8%）,其次是亚胺培南（38.5%）、美罗培南（40.0%）和阿米卡星（46.2%）;在25株耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IRPA）中,有19株oprD2基因缺失,缺失率为76.0%。结论铜绿假单胞菌耐药性严重;外膜通道蛋白oprD2缺失可能是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要原因之一。     

转化生长因子β1对种植体表面成骨细胞I型胶原蛋白基因表达研究

目的：通过观察特定浓度的转化生长因子β1（TGF-β1）,在不同时间刺激体外培养种植体表面成骨细胞中I型胶原蛋白表达情况,探讨TGF-β1对种植体表面成骨细胞增殖分化的影响。方法：体外培养成骨细胞模拟种植体植入后的体内环境接种于钛片表面,将其分为2个浓度刺激组和对照组。刺激组分别加入0.5ng/mL、10ng/mL的TGF-β1刺激细胞增殖和分化,分别收集刺激后第2d、5d、7d培养的细胞。通过RT-PCR检测不同培养时间成骨细胞中的I型胶原蛋白mRNA表达,对照组不加TGF-β1,比较各组间差异程度。结果：浓度为0.5ng/mL的外源性TGF-β1加入到接种于模拟体内种植体的钛片表面的成骨细胞中后,可显著增加成骨细胞中I型胶原蛋白表达（P〈0.05）;而浓度为10ng/mL的外源性TGF-β1可降低成骨细胞中I型胶原蛋白的表达（P〈0.05）。TGF-β1刺激后的I型胶原蛋白在不同时间培养的成骨细胞中,表达在凝胶成像系统光密度分析后可见与对照组中表达量相比,低浓度刺激组表达量略有升高,高浓度刺激组表达量略有降低。结论：浓度为0.5ng/mL的TGF-β1对I型胶原蛋白的表达有促进作用;浓度为10ng/mL外源性TGF-β1对I型胶原蛋白表达有抑制作用。     

铜绿假单胞菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因的研究

目的了解广州地区质粒介导喹诺酮类耐药（PMQR）基因在铜绿假单胞菌中的流行状况并分析其与耐药之间的关系。方法收集2005-2007年临床分离到的212株铜绿假单胞菌,采用K-B纸片扩散法进行药敏试验,通过PCR检测质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS、qnrC、qnrD、aac（6’）-Ib-cr和qepA,并对阳性扩增产物进行DNA测序分析。结果 212株铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为10.8%（23/212）和19.3%（41/212）。qnrB、qnrS和aac（6’）-Ib-cr的阳性率分别为0.9%（2/212）、0.5%（1/212）和0.9%（2/212）,qnrA、qnrC、qnrD、qepA未检出。4株PMQR基因阳性菌株中,仅1株对左氧氟沙星表现为耐药,其余对环丙沙星和左氧氟沙星均表现为敏感。结论 2005-2007年间广州地区铜绿假单胞菌耐药现象严重,该地区铜绿假单胞菌中已携带有PMQR基因,且敏感菌株中也有该类基因存在。     

耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性及危险因素分析

目的分析耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性及其产生的危险因素，为临床合理使用抗生素提供依据和探讨该耐药菌的防治方法。方法采用常规方法检测我院2003～2007年临床标本分离的耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性，并回顾性分析比较该菌感染患者在院内采取的各项措施、病情发展等危险因素。结果2003～2007年共分离出769株铜绿假单胞菌，其中195株是耐亚胺培南株，占25．3％，每年耐亚胺培南株的检出率依序分别为15．7％、11．9％、13．8％、24．1％、41．4％。耐亚胺培南铜绿假单胞菌对其它抗生素的耐药率最低的是多粘菌素E（0．2％），对氨基糖苷类的阿米卡星（46．1％）、庆大霉素（52．3％）和妥布霉素（52．6％）也相对较低。该菌感染单因素分析：入住ICU、使用广谱抗生素大于3周、住院时间超过4周、气管插管或气管切开、2周内接受碳青酶烯类治疗是耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的危险因素。结论耐药性铜绿假单胞菌逐年增多，合理使用抗菌药物、缩短患者ICU住院时间、增强机体免疫功能等，减少院内感染机会，有利于防止耐亚胺培南铜绿假单胞菌的产生。     

喹诺酮信号分子对铜绿假单胞菌毒力的影响

目的探讨喹诺酮信号分子（PQS）对铜绿假单胞菌（PA）毒力的影响。方法选择PAO1作为实验菌,分为PQS组、PQS与
抑制剂组、抑制剂组以及正常组。QPCR方法检测Ⅲ型分泌系统（T3SS）的调节基因ExsA和毒力蛋白基因ExoS的转录水平;分
光光度计检测绿脓素生成量;作用肺泡上皮细胞A549,用平板计数法比较PAO1粘附和侵袭力;构建小鼠腹膜炎模型,观察PQS
对小鼠存活时间的影响。结果PQS增多和减少不影响PAO1 的成长情况。与正常组相比,PQS组的ExsA与其调控表达的
ExoS 毒力蛋白基因转录水平均显著升高（P<0.01）;PQS组PAO1 产生的绿脓素也明显升高,抑制组却明显下降（P<0.01）;与
A549细胞作用时,抑制剂组PAO1的粘附和侵袭力均显著降低;腹膜炎模型小鼠PQS组存活时间也降低明显（P均<0.01）。抑
制剂组Exos的转录水平有降低,差异有统计学意义（P<0.05）。与正常组比较,抑制剂组的ExsA转录水平无明显差异,PQS组
PAO1的粘附力和侵袭力没有改变（P均>0.05）。结论在PA感染宿主的整个过程中,PQS能维持粘附和侵袭能力,PQS的浓度
与绿脓素的产生有正相关关系,从而最终使宿主的存活时间成负相关。
     

定向RNA—Seq技术在铜绿假单胞菌的应用

目的探讨定向转录组测序技术在铜绿假单胞菌的应用,为研究基因组的注释和表达调控提供重要手段。方法抽提菌体RNA并去除rRNA,连接接头后用特异性引物反转录成cDNA,PCR扩增后测序;所得数据采用Bowtie和rSeq软件分析。结果在所有26557654条读段中,除去无效读段209928条,与基因组匹配的读段为26347726条,测序结果能覆盖几乎99％的基因组,78．7％的基因来源于两个方向转录本映射读段,读段数最高的基因是ssrA,发现新的基因2283个。结论成功建立了铜绿假单胞菌中的定向RNA—Seq技术。