APA微囊免疫隔离效应的体外测定

目的：在体外了解海藻酸钙—多聚赖氨酸—海藻酸钙微胶囊(APA)的免疫隔离效应。方法：用下列方法测定APA微囊的免疫隔离效应，用激光共聚焦显微镜测定荧光素标记的IgG微囊膜的扩散；NK细胞对裸露或微囊化K562细胞的杀伤作用；BCCs刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的保护效应，IL—2及TNF—α对共培养的细胞或微囊化细胞的杀伤作用。结果：微囊具有阻断IgG免疫球蛋白扩散作用；并且有效地保护囊内K562细胞不受NK细胞的杀伤；防止BCCs刺激小鼠脾淋巴细胞增殖反应；IL—2 TNF—α均可通过APA微囊膜，支持IL—2依赖细胞CTLL—2的生存；及对囊内的L929靶细胞产生杀伤作用。结论：APA微囊膜可有效地隔离抗体及淋巴细胞介导的体液和细胞免疫反应。     

微囊化人血管抑素基因工程细胞对人脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的了解海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(alginate-polylysine-alginate,APA)微囊化人血管抑素基因工程细胞对人脐静脉内皮细胞(Huecv304)增殖的影响。方法采用APA制备微囊包裹的表达人血管抑素(human angiostatin,hAS)的基因工程细胞(APA-hAS/293细胞微囊)或空载体转染的基因工程细胞(APA-0/293细胞微囊)。分别将上述两种细胞微囊以不同浓度与人脐静脉内皮细胞Huecv304细胞共培养,于培养0、24、48及72h时,以MTT法测定Huecv304细胞的增殖情况。结果 APA-hAS/293细胞微囊对共培养的Huecv304细胞的增殖具有明显的抑制作用(P<0.01),且具有良好的量效关系。而对照组APA-0/293细胞微囊对Huecv304细胞的增殖无明显抑制作用。结论体外培养的表达人血管抑素基因的工程细胞的分泌物可以通过微囊膜并对人脐静脉内皮细胞的增殖产生显著的抑制效应。     

大体系冻存对细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响

目的探讨大体系(50 mL)冻存对细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞免疫表型及细胞杀伤活性的影响。方法采集6例健康志愿者的外周血,采用Ficoll法分离得到单个核细胞,用细胞因子诱导培养CIK细胞。收集冻存1个月后复苏的CIK细胞,采用流式细胞术检测其冻存前后的细胞活率和免疫表型;通过与乳腺癌细胞共培养(效靶比10∶1和40∶1)的方法测定其杀伤活性,与新鲜未冻存的细胞杀伤活性进行比较,同时并对不同效靶比冻存前后的细胞杀伤活性进行比较。结果 CIK细胞大体系冻存前平均细胞活率(97.79±1.92)%,显著高于复苏后的(83.61±3.42)%(P<0.05)。复苏后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD4~+、CD3~+CD8~+、CD3~+CD56~+表型CIK细胞所占比例虽较冻存前稍有降低,但差异均无统计学意义(P>0.05)。效靶比10∶1、40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率比较差异均无统计学意义(P>0.05);效靶比40∶1时冻存前细胞和复苏后细胞杀伤率均显著高于效靶比10∶1时(P<0.05)。结论大体系(50 mL)冻存对于CIK细胞活率虽有影响,但对免疫表型和细胞活性均未影响。     

直接用于输注的临床级细胞冻存保护剂的动物体内外安全性评价

目的 探索研究一种安全有效的可以直接用于输注的临床级细胞冻存保护剂.方法 采集50份脐带血, 使用羟乙基淀粉沉淀法分离得到脐血有核细胞, 加入5种不同浓度的冻存保护剂 (DMSO、人血白蛋白、勃脉力A) , 于液氮中冻存6个月, 检测并比较冻存前后有核细胞、CD34+细胞、细胞集落形成单位、回收率和台盼蓝拒染率;将不同浓度的冻存保护剂经尾静脉注射到小鼠体内, 评估其安全性.结果 A组 (10%DMSO+5%人血白蛋白+勃脉力A) 与C组 (7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A) 台盼蓝拒染率、有核细胞回收率、CD34+细胞回收率和集落形成单位回收率无统计学差异 (P>0.05) 且高于其它3组 (P<0.05) , 但A组的肝脏毒性高于其它组 (P<0.05) .结论 7.5%DMSO+10%人血白蛋白+勃脉力A是一种安全有效的冻存保护剂.     

低温冻存对人脐血CD3AK某些生物学特性的影响

目的探讨人脐血CD3AK细胞的最佳诱导体系及低温保存对其生物特性的影响.方法以最适离心参数制备单个核细胞.用CD3McAb、完全培养基、人AB血清或同一自体脐血清,设计不同浓度组以优化诱导体系.经最佳诱导体系培养的CD3AK细胞低温保存不同时间后复苏.检测免疫表型、活率以及细胞集落形成率.结果最佳诱导体系为(15%自体脐血清+85%全培基+自体红细胞+CD3McAb),诱导的人脐血CD3AK细胞形态良好,低温冻存150天,免疫表型的变化无显著性,复苏活率均数高于90%,细胞集落形成率下降则有显著意义.结论以最佳诱导体系培养的人脐血CD3AK细胞可低温保存一定时间,其免疫表型的变化无显著性,复苏活率均数高于90%.这对临床生物治疗有实用意义.     

核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),C...     

低温冻存对人脐血CD3AK某些生物学特性的影响

目的 探讨人脐血CD3AK细胞的最佳诱导体系及低温保存对其生物特性的影响。方法 以最适离心参数制备单个核细胞。用CD3McAb、完全培养基、人AB血清或同一自体脐血清,设计不同浓度组以优化诱导体系。经最佳诱导体系培养的CD3AK细胞低温保存不同时间后复苏。检测免疫表型、活率以及细胞集落形成率。结果 最佳诱导体系为（15％自体脐血清＋85％全培基＋自体红细胞＋CD3McAb),诱导的人脐血CD3AK细胞形态良好,低温冻存150天,免疫表型的变化无显著性,复苏活率均数高于90％,细胞集落形成率下降则有显著意义。结论 以最佳诱导体系培养的人脐血CD3AK细胞可低温保存一定时间,其免疫表型的变化无显著性,复苏活率均数高于90％。这对临床生物治疗有实用意义。     

蛛网膜下腔移植APA-MH3T3/rPENK对大鼠神经痛的镇痛效应

目的:探讨海藻酸钠一聚赖氨酸.海藻酸钠(APA)微囊化转鼠前脑啡肽原基因NIH3T3细胞(APA-NIH3T3/rPENK)移植对大鼠神经痛的镇痛作用.方法:50只SD大鼠随机分为5组:CCI(坐骨神经慢性压迫)组、假手术组、APA空囊组、NIH3T3/rPENK组和APA-NIH3T3/rPENK组.测定CCI组和假手术组手术前后,APA空囊组、NIH333/rPENK组和APA-NIH3T3/rPENK组移植前后CCI术侧热痛阈,观察腹腔注射纳洛酮对细胞镇痛效应的影响,同时用放射免疫法检测脑脊液灌流液中亮氨酸脑啡肽(L-EK)含量.结果:CCI术后7～33 d术侧后爪热痛阈明显低于非术侧后爪(P<0.05).APA空囊组移植前后热痛阈未见明显变化;移植后NIH3T3/rPENK组和APA-NIH3T3/rPENK组热痛阈都明显高于APA空囊组(P<0.05).移植15 d后NIH333/rPENK组热痛阈显著低于APA-NIH3T3/rPENK组(P<0.05).移植21 d后APA空囊组脑脊液灌流液中L-EK含量显著低于NIH3T3/rPENK组和APA-NIH333/rPENK组(P<0.05);NIH3T3/rPENK组脑脊液灌流液中L-EK含量显著低于APA-NIH3T3/rPENK组(P<0.05).结论:NIH333/rPENK或APA-NIH3T3/rPENK植入大鼠的蛛网膜下腔可以明显减轻神经痛大鼠的热痛敏感行为.APA-NIH3T3/rPENK效果更明显,提示APA微囊具有良好的免疫隔离作用.     

不同人羊膜间充质干细胞冻存液冻存细胞效果比较

目的:筛选冻存人羊膜间充质干细胞效果较好的冻存液.方法:①不同配方的细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.人羊膜问充质干细胞培养至第三代后分为10组,分别加入以下10种不同组成的冻存液.A组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%DMSO;B组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%DMSO;C组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;D组:90%胎牛血清+10%DMSO;E组:70%DMEM/F12+20%胎牛血清+10%甘油;F组:60%DMEM/F12+30%胎牛血清+10%甘油;G组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%甘油;H:90%胎牛血清+10%甘油;I组:90%DMEM/F12+10%DMSO;J组:90%DMEM/F12+10%甘油.调整细胞密度为5×106mL-1,放入程序降温盒中,入-80℃低温冰箱保存.1个月后复苏,MTT法筛选出吸光光度值较高的一种冻存液.②相同血清含量细胞冻存液对细胞冻存效果的影响.含体积分数为50%胎牛血清的细胞冻存液分3组保存细胞.K组:45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO;L组:40%DMEM/F12+50%胎牛血清+10%DMSO;M组:35%DMEM/F12+50%胎牛血清+15%DMSO;复苏冻存的细胞后.将细胞按冻存前的数量调整至5×1O5mL-1,台盼蓝染色后,计算细胞的成活率.在倒置相差显微镜下观察细胞的生长状况.结果及结论:配方为45%DMEM/F12+50%胎牛血清+5%DMSO的冻存液冻存复苏人羊膜间充质干细胞后细胞的成活率最高(P<0.05);冻存复苏后细胞的生长状况较好.     

人骨髓基质细胞冻存技术的初步研究

目的　探索适合于人骨髓基质细胞 - 196℃冷冻保存条件和方法。方法　以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养 ,传代后以不同浓度二甲亚砜 (DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存 ,2个月后复苏接种培养 ,对其存活率、贴壁率和体外成骨能力进行检测。结果　不同DMSO浓度保存细胞复苏后细胞的存活率从高到低依次为 10 %DMSO组、5 %DMSO组、15 %DMSO组、2 0 %DMSO组 ;在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现细胞结节 ,碱性磷酸酶染色阳性 ;冻存时细胞浓度为每毫升 (5 .0～ 8.0 )× 10 6个细胞组复苏后细胞存活率高于每毫升 (1.0～2 .5 )× 10 6个细胞组。结论　 5 % - 10 %DMSO浓度适合于骨髓基质细胞的长期保存 ,高浓度组骨髓基质细胞的冻存效果优于低浓度组。     

稳定表达神经营养素-3的NIH3T3细胞建立及鉴定

目的：建立稳定表达NT3的NIH3T3细胞株，通过体外共培养实验观察其对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响．方法：以阳离子脂质体作为载体，将携带有外源性基因NT3的重组真核表达载体pIRES2-EGFP-NT3转染小鼠成纤维细胞，进行RT-PCR，Western-blot分析及免疫组化鉴定，并与耳蜗螺旋神经节细胞进行共培养实验．结果：得到抗G-418的阳性细胞克隆；RT-PCR的产物约为744 bp；Western-blot可见一清晰的蛋白条带，与NT3的蛋白分子量相符合．NT3免疫组化染色结果显示转染NT3-cDNA的NIH3T3细胞胞质呈棕黄色着色．NT3转染组细胞与耳蜗螺旋神经节细胞共培养2wk后，与对照组相比，耳蜗螺旋神经节细胞无明显减少．结论：成功建立了稳定表达NT3的NIH3T3细胞株；该细胞对耳蜗螺旋神经节细胞有很好的营养支持作用．     

反应温度对生物标记用Na3 ZrF7：Yb3＋，Er3＋纳米探针上转换发光的影响

目的：研究温度对上转换发光性能的影响。方法：通过水热法制备Na3 ZrF7：Yb3＋,Er3＋纳米粒子;采用TEM, XRD和荧光光谱探究合成温度对其上转化发光性能的影响。结果：温度变化会影响纳米粒子的尺寸和晶型,进而影响其上转换发光。结论：Na3 ZrF7：Yb3＋,Er3＋纳米粒子的发光强度随合成温度的升高而逐渐增强。     

血清rT_3和T_3/rT_3对危重病新生儿预后探讨

我院NICU及新生儿病房自1996年3月至1996年12月，应用放射免疫法测定了新生儿窒息、感染和健康新生儿共120例血清T3和rT3，并进行了动态观察。结果表明；①危重病新生儿的rT3升高程度与疾病的严重程度呈正相关，特别是rT3＞4000ng／L者，提示疾病危重，预后不良；②危重病新生儿的T3/rT3值与疾病的严重程度呈负相关，特别是T3/rT3值＜0.5者，提示疾病危重，预后不佳；③血清rT3的水平及T3／rT3的比值，可作为临床疾病严重程度和预后估计的指标之一。     

反义Smad3抑制3T3细胞增殖和TGF-β1基因表达

目的 研究反义Smad3对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因表达的调控和对3T3细胞增殖的影响。方法 构建反义Smad3质粒,以脂质体介导转染NIH3T3细胞,进行细胞计数,并用RT-PCR方法观察TGF-β1 mRNA的表达。 结果 反义Smad3能下调TGF-β1 mRNA的表达,并抑制3T3细胞增殖。 结论 可以通过阻断TGF-β1细胞内信号传导调控TGF-β1基因的表达并抑制细胞增殖。     

硫化氢对脂肪细胞前体增殖的影响

目的：探讨硫化氢对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。方法：培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低剂量组和高剂量组（硫化氢浓度分别为0、10、25、50和100μmol/L）,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测硫化氢对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响;用BRDU法检测细胞的增殖;结果：与对照组相比,H2S在较高浓度时,对细胞有一定的毒性作用（P〈0.05）。结论：硫化氢抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:研究硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低硒组、中硒组和高硒组(亚硒酸钠浓度分别为0、0.01、0.1和1μmol/L),采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定硒对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:在增殖实验中,与对照组相比,各处理组的OD值降低,并具有剂量依赖性(P<0.05);在分化实验中,各处理组的OD值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:硒能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,而对其分化无影响。     

人白介素-10在NIH3T3细胞中的表达及生物学效应的初步观察

目的观察IL-10的免疫抑制作用.方法将构建好的pLXHIL-10载体,经包装细胞PA317包装后感染小鼠成纤维细胞株NIH3T3,用ELISA和原位杂交的方法检测hIL-10的表达,并对其生物学活性进行初步观察.结果检测到感染细胞中有hIL-10 mRNA的表达,感染细胞培养上清中存在hIL-10,证实感染细胞培养上清对混合淋巴细胞培养反应有明显的抑制作用.结论hIL-10可抑制混合淋巴细胞反应.     

稳定表达NT-3的NIH3T3细胞对小鼠耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响

目的通过体外共培养观察NT-3对耳蜗螺旋神经节细胞生长的影响.方法建立能够稳定表达、分泌NT-3蛋白的NIH3T3细胞系;选择出生2～4 d的BALA/CA小鼠,进行耳蜗螺旋神经节细胞原代培养并分为3组,其中Ⅰ组与稳定分泌NT-3的NIH3T3细胞共培养,Ⅱ组与传染空载体NIH3T3细胞共培养,Ⅲ组与NIH3T3细胞共培养,共培养2周后,观察各组螺旋神经节细胞的数量及轴突长度的变化.结果共培养2周后,与对照组相比,NIH3T3-NT-3共培养组SGC的数量以及突起的长度均显著高于对照组.结论NT-3可显著减轻耳蜗螺旋神经节神经的退行性改变.     

Foxp3、CD3在非小细胞肺癌组织中的表达及意义

目的探讨Foxp3、CD3在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其与肺癌临床病理特征和预后的关系。方法选取62例NSCLC患者术后的肺癌组织标本（NSCLC组）及27例正常肺组织（距离肿块边缘5cm以上正常肺组织或另一叶肺组织）作为正常对照组。采用免疫组化方法分别检测两组组织中Foxp3、CD3表达的表达情况,并分析其与肺癌临床病理特征（年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移与否）的关系。结果NSCLC组Foxp3、CD3阳性细胞数均显著多于正常对照组（P〈0．01）。两者显著相关（P〈001）。Foxp3阳性表达仅在不同分化程度间存在明显差异,低分化者Foxp3阳性细胞浸润量高于高、中分化者（P〈0．05）;CD3阳性表达仅在不同术后pTNM分期间存在明显差异,ⅢB期、Ⅳ期NSCLC组织中CD3阳性细胞数明显减少（P〈0.05）。Foxp3表达与患者术后生存时间无关（P〉0.05）,CD3阳性细胞数与NSCLC患者术后生存时间呈线性正相关（P〈0．01）,Foxp3阳性细胞数与CD3阳性细胞数比值（Foxp3／CD3）与患者生存时间呈线性负相关（P〈0.05）。pTNM分期、CD3阳性细胞绝对数有统计学意义,可作为NSCLC患者的独立预后因素。结论NSCLC组织中CD3阳性细胞数低、Foxp3／CD3大者T细胞肿瘤免疫作用抑制,影响患者术后生存时间。联合检测术后肺癌组织中Foxp3、CD3,并结合患者术后病理分期可以更好地评估NSCLC患者手术预后。