pEGFP-N1-Mxi1-0重组质粒的构建与表达

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0) 的真核表达载体,在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH/3T3)中表达,以期为深入研究Mxi1-0的作用及机制奠定基础。方法:通过RT-PCR方法从人肿瘤细胞HepG2中获得Mxi1-0基因的编码片段,连接至增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)构建成pEGFP-N1-Mxi1-0。经酶切和测序鉴定重组质粒的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光显微镜观察和Western blot方法检测Mxi1-0表达,免疫荧光法检测Mxi1-0在NIH/3T3细胞内的定位情况。结果:经双酶切和核酸序列测序鉴定证实含Mxi1-0的重组真核表达载体pEGFP-Mxi1-0构建成功。重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞后,检测到Mxi1-0的成功表达,并证实Mxi1-0主要定位于NIH/3T3细胞质中。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mxi1-0,并检测到Mxi1-0的表达,实验证明Mxi1-0定位于NIH/3T3细胞质中。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lvgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达。方法采用PCR方法将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞。结果通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpG中lvgA/CpG克隆片段长为657bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合。用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达。结论本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达.方法 采用PCR方法 将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞.结果 通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpC中lvgA/CpC克隆片段长为657 bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7 Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合.用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达.结论 本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号.     

重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子基因在NIH3T3细胞中的表达

目的:构建广西眼镜蛇蛇毒神经生长因子(NGF)基因的真核表达载体pcDNA3.1(一)-NGF,并在NIH3T3细胞中进行表达.方法:采用RT-PCR的方法扩增蛇毒NGF的基因片段,将目的基因、真核表达载体pcDNA3.1(一)分别酶切后回收,连接,转化而构建重组表达载体pcDNA3.1(一)-NGF,经酶切和测序对重组体进行鉴定.利用脂质体LipofectamineTM2000方法转染NIH3T3细胞,对阳性克隆裂解上清中NGF的表达用SDS-PAGE、Western-blot的方法检测.结果:重组载体经酶切、测序分析,插入的基因片段为表达蛇毒NGF的基因,NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达.结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(一)-NGF,并检测出在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步开展NGF基因治疗神经系统的疾病奠定了实验基础.     

H3N2流感病毒非结构蛋白-1真核表达载体的构建与表达及其对293T细胞增殖的影响

目的:构建甲型H3N2流感病毒非结构蛋白-1( nonstructal-1,NS1)真核表达载体并表达其编码蛋白;探讨NS1对细胞增殖的影响?方法:从江苏省甲型H3N2流感病毒毒株提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/NS1质粒,双酶切pMD18-T/NS1与pXJ40-HA后,构建真核表达载体pXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达?3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法检测NS1转染细胞后对细胞增殖的影响? 结果:经双酶切?测序鉴定证实NS1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实NS1蛋白的表达?MTT法证实转染NS1质粒后对细胞增殖有抑制作用?结论:成功克隆了NS1全长基因,构建了其真核表达载体,并初步验证了NS1蛋白过表达后能抑制细胞的增殖,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1的细胞模型和NS1蛋白对细胞增殖和凋亡作用机制的进一步研究提供了基础?     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的 构建小鼠植烷酸氧化酶(Phyh)真核表达载体,并观察其在NIH 3T3细胞中的表达定位情况.方法 提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH 3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA.Phyh在NIH 3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析.结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH 3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中.结论 成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH 3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具.     

iASPP真核表达载体的构建及其对NIH3T3细胞增殖的影响

目的：构建iASPP真核表达载体,稳定转染小鼠成纤维细胞（NIH3T3）并检测其表达,观察其对NIH3T3细胞增殖的影响。方法：设计引物以源克隆PCMV-iASPP为模板PCR扩增其中的CDS区,亚克隆入FLAG-pcDNA3.0,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌,筛选阳性克隆,经酶切、测序鉴定后,用脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418加压筛选28 d,RT-PCR、West-ern blotting检测基因、蛋白表达;MTT法观察细胞增殖能力。结果：重组质粒鉴定正确,筛选所得阳性克隆中可以检测到iASPP基因的转录和表达,且该iASPP阳性表达细胞株增殖能力明显增强。结论：成功构建iASPP真核表达载体并成功构建稳定表达iASPP的NIH3T3细胞株,证明该基因的稳定表达在体外能显著增强NIH3T3细胞增殖能力。     

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

Max二聚化蛋白1（Mad1）真核表达载体的构建及其对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响

目的：构建Max二聚化蛋白1 (Max dimerization protein 1,Mad1) 的真核表达载体,研究Mad1对胃癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法：利用DNA重组技术将Mad1基因克隆至pEGFP-N1载体,构建成pEGFP-N1-Mad1重组真核表达载体。经酶切和测序鉴定后,采用脂质体转染技术将重组质粒瞬时转染人胃癌AGS细胞, RT-PCR及Western blot检测Mad1基因和蛋白的表达。荧光显微镜观察Mad1在AGS细胞内的定位情况。CCK-8和Transwell实验研究Mad1对胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。结果：成功构建携带Mad1基因的真核表达载体pEGFP-N1-Mad1。将重组质粒瞬时转染AGS细胞后,RT-PCR和Western blot检测到Mad1 基因和蛋白的表达。Mad1基因表达产物定位于AGS细胞核中。CCK-8和Transwell实验结果显示,转染Mad1的AGS细胞与转染空载体的AGS细胞、及正常AGS细胞相比,细胞增殖活力和迁移能力明显降低。 结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-Mad1,研究表明Mad1可以抑制胃癌AGS细胞的增殖和迁移。     

核仁磷酸蛋白突变基因表达对NIH3T3细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM)突变基因对小鼠NIH3T3成纤维细胞系体外增殖和凋亡的影响以及其分子机制。方法通过脂质体介导将真核表达载体pEGFP-C1-NPMc+转染NIH3T3细胞,G418筛选稳定表达NPM突变蛋白细胞株,RT-PCR和Western blot检测NPM突变基因和蛋白的表达。MTT、克隆形成实验检测细胞体外增殖能力;FCM检测细胞周期分布及凋亡水平的改变,并通过对周期调控因子p21及凋亡相关分子Caspase-3活性检测,初步探讨NPM突变参与细胞恶性增殖的分子机制。结果建立了稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞株。NPM-mA实验组细胞较对照组细胞增殖能力及平板克隆形成率明显增高(P<0.05);甲基纤维素集落形成实验显示各组细胞在甲基纤维素上均不能形成集落;与对照组比较,NPM-mA实验组细胞中G1期细胞比例(42.27±0.86)%显著减低(P<0.01),S期细胞比例(43.08±0.74)%显著增加(P<0.01),同时伴有p21 mRNA水平下降,稳定表达NPM突变基因的NIH3T3细胞凋亡率(1.00±0.13)%明显降低(P<0.01),C...     

Max作用蛋白1-0缺失突变体的构建、表达及细胞内定位的研究

目的:构建Max作用蛋白1-0(Max interacting protein1-0,Mxi1-0)缺失突变体的真核表达载体并观察这些突变体在细胞内的定位情况,为研究Mxi1-0细胞内定位与其功能的关系奠定基础。方法:以野生型Mxi1-0真核表达质粒为模板,聚合酶链式反应扩增出5种类型Mxi1-0缺失突变体的基因片段,克隆至增强绿色荧光蛋白真核表达载体,经酶切和测序鉴定后,利用脂质体将重组质粒转染小鼠胚胎成纤维细胞株(NIH3T3)。Western blot检测融合蛋白的表达,荧光显微镜下观察融合蛋白细胞内定位情况。结果:各种Mxi1-0缺失突变体经测序鉴定正确后,在NIH3T3中得到表达。免疫荧光结果表明,脯氨酸富集结构域(PRD)突变体在细胞质和细胞核中均有分布,与Sin3结合域高度同源结构域(tSID)突变体主要分布于细胞质,在细胞核中有少量分布;PRD-tSID突变体及△PRD突变体分布于细胞质,而△PRD-tSID突变体主要分布于细胞核。结论:成功构建了5种人Mxi1-0缺失突变体的真核表达载体,并初步观察这些突变体在细胞内的定位情况,为探寻Mxi1-0在细胞内定位机制及功能奠定了基础。     

pEGFP-N1/Arf6-T27N重组真核表达载体的构建及其在人乳腺癌细胞株中的表达

目的:构建含有Arf6-T27N基因的重组真核表达载体,并检测Arf6-T27N蛋白在MDA-MB-231人乳腺癌细胞中的表达情况,以期为深入研究Arf6在乳腺癌细胞迁移中的作用机制奠定基础?方法:从含Arf6-T27N基因的真核表达质粒pXS-Arf6-T27N中扩增出Arf6-T27N基因,插入pEGFP-N1载体中构建成pEGFP-N1/Arf6-T27N,利用脂质体将其转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞?用新霉素筛选稳定表达的细胞系,Western blot确定重组蛋白表达,并用Boyden chamber小室实验检测转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞迁移能力的改变?结果:限制性内切酶鉴定和核酸定列测定证实成功构建了含Arf6-T27N的重组真核表达载体pEGFP-N1/Arf6-T27N?以重组质粒稳定转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞,能检测到Arf6-T27N蛋白的表达,且Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231人乳腺癌细胞的迁移?结论:成功构建了重组质粒pEGFP-N1/Arf6-T27N,稳定转染Arf6-T27N的MDA-MB-231人乳腺癌细胞可检测到其蛋白水平的稳定表达,重组质粒介导的Arf6-T27N蛋白能明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移?     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

14-3-3γ表达载体的构建及其对子宫肌瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 ：构建一种稳定、高表达的14-3-3γ基因真核表达质粒载体,并探索其抗子宫肌瘤的作用。方法：提取子宫肌瘤细胞总RNA,反转录后通过RT-PCR扩增14-3-3γ,并将扩增的目的基因片段插入pCMV-N-Flag真核表达质粒,构建重组质粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag,重组体经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术导入子宫肌瘤细胞。应用Western Blot法检测14-3-3γ蛋白的表达,应用CCK-8检测细胞增殖变化,应用Annexin V-FITC/PI双染色法经流式细胞术检测细胞凋亡。结果：①构建的14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表达载体经酶切后电泳和DNA测序,显示载体构建正确;②子宫肌瘤细胞转染重组体后的14-3-3γ表达明显高于转染前（P＜0.05）;③子宫肌瘤细胞转染重组体后,细胞增殖抑制率为52.90%（P＜0.05）;④转染重组体后肌瘤细胞的凋亡率明显高于转染前（P＜0.05）。结论：本研究成功构建14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表达质粒载体,14-3-3γ在子宫肌瘤细胞内高表达后可抑制细胞的增殖和促进细胞凋亡。