人7型腺病毒的分离与鉴定

目的对哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸道感染患者的痰或咽拭子标本进行检测、分离鉴定和分型。方法应用直接免疫荧光法对标本进行初步筛检,将筛检得到的腺病毒阳性标本接种到A549细胞进行病毒培养,并用空斑法进行纯化。采用PCR技术扩增腺病毒五邻体、六邻体基因,将扩增的PCR产物进行基因测序,并将测序结果BLAST比对,初步判断其型别。结果从采集的标本中分离到1株人腺病毒毒株。 BLAST比对五邻体、六邻体测序结果,表明该毒株与人7型腺病毒五邻体、六邻体的同源性为100％,初步判定该毒株为人7型腺病毒。结论从哈尔滨医科大学附属第二医院呼吸道感染患者的痰或咽拭子标本中分离到1株人7型腺病毒。     

呼吸道感染人腺病毒的分离及鉴定

目的进行呼吸道感染人腺病毒的分离以及型别鉴定。方法标本来源于本实验室检测腺病毒阳性的1例呼吸道感染临床患者痰标本,将该例标本经处理后接种肺癌A549细胞进行病毒培养,用空斑实验进行病毒的分离和纯化,以纯化后的病毒核酸提取物为模板用PCR方法扩增腺病毒六邻体蛋白基因,对扩增产物进行序列测定,测序结果进行BLAST序列分析确定其型别。结果分离到一株人腺病毒毒株,对其六邻体蛋白基因PCR产物测序和BLAST分析结果证明该腺病毒株的六邻体序列与人7型腺病毒六邻体基因同源性均为100%。结论从哈尔滨地区呼吸道感染患者痰标本中检测到的1例腺病毒经分离鉴定为人腺病毒7型。     

深圳市儿童呼吸道腺病毒4型暴发流行的病原学研究

目的探讨深圳市某幼儿园一起急性呼吸道感染暴发的流行特征及病因。方法使用荧光定量PCR方法对采集的17份患儿咽拭子进行流感样病例筛查,筛查后的阴性样本进一步进行呼吸道腺病毒核酸检测,对检测出的5份腺病毒阳性标本进行病毒分离,感染Hep-2受体细胞后共获得4份腺病毒稳定细胞毒株,用腺病毒六邻体基因作为靶基因进行序列扩增及测定,测序结果在GenBank上进行序列比较,确定其病毒亚型并进行系统进化分析。结果 17份咽拭子中5份为腺病毒PCR阳性,阳性率为29.4%,用分型引物检测并分析序列确定均为腺病毒4型。结论本次急性呼吸道病毒疫情暴发由腺病毒4型引起。     

人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究

目的分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势。方法采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13)。利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势。结果该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%。结论引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义。     

Isolation and identification of human adenovirus type 3 GZ13 strain and the molecular evolution of hexon protein.

目的 分离鉴定1株引起儿童急性支气管肺炎的腺病毒及分析其主要中和抗原六邻体蛋白的分子进化趋势.方法 采用荧光定量PCR方法,对1例引起严重支气管肺炎的患儿咽拭子进行检测,并从中分离得到1株腺病毒(命名为GZ13).利用型特异性引物PCR进行初步亚型鉴定;克隆该株腺病毒完整的六邻体蛋白基因,测序和序列比对,确定其型别;同时与GenBank上人3型腺病毒的六邻体蛋白进行同源性比对,分析预测六邻体蛋白的分子进化趋势.结果 该临床标本经荧光定量PCR鉴定为腺病毒强阳性,型特异性引物PCR初步鉴定为3型;完整六邻体基因比对最终确定为人3型腺病毒;GZ13株与我们先前分离的GZ01、GZ02株及台湾地区分离株核苷酸及氨基酸的同源性均大于99%.结论 引起该例儿童急性支气管肺炎的病原体为人3型腺病毒,目前在广州以及台湾地区流行的3型腺病毒仍属同一流行株,其主要中和性抗原六邻体蛋白未出现明显变异,这对今后开发研究人3型腺病毒疫苗及药物具有重要指导意义.     

一起柯萨奇病毒A6型引起的手足口病聚集性疫情分子流行病学分析

目的 对2019年9月辽宁省阜新市某中学一起手足口病聚集性疫情的未分型肠道病毒进行病原学鉴定,分析其种系发生情况。方法 使用实时荧光PCR对标本进行初步病原学鉴定,使用巢式PCR对未分型肠道病毒VP1区部分核苷酸序列进行扩增和测序,BLAST比对确定肠道病毒型别,利用生物信息学软件将VP1区全长序列与柯萨奇病毒A6型（CV-A6）各亚型参考序列进行同源性和系统进化分析。结果 5份标本经实时荧光PCR检测,结果显示肠道病毒通用型核酸阳性,CV-A16型和EV71型核酸均为阴性,判断为非CV-A16非EV71型肠道病毒感染。对肠道病毒VP1区部分核苷酸序列进行在线BLAST比对,结果显示5例患者标本均为CV-A6型肠道病毒阳性,其VP1区核苷酸序列同源性为100%。系统进化分析显示,5例标本属于我国广泛流行的CV-A6 D3亚型,且与辽宁省近几年的优势流行株在同一个进化树分支上。结论 引起此次聚集性手足口病疫情的病原体为CV-A6型肠道病毒,与近年来辽宁省流行的CV-A6毒株亲缘关系密切,未发生明显变异。     

肺炎衣原体荧光PCR检测方法的建立和应用

目的采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法。方法对GenBank登录的肺炎衣原体的基因序列进行生物信息学分析,针对保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR检测方法。对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测。采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价。结果本实时荧光PCR方法对甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应。本院的临床样本检出26份,其中咽拭子9份,肺泡冲洗液17份。结论肺炎支原体荧光PCR检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断。     

深圳市一起腺病毒4型感染聚集性疫情的分子流行病学调查

目的 分析2019年2月22—28日深圳市宝安区某小学一起急性呼吸道病毒感染聚集性疫情的流行病学及病原学特点。方法 采用流行病学个案调查表对疫情进行现场调查,使用荧光定量PCR方法对采集的咽拭子标本进行流感样病例病原学筛查,筛查阴性标本进行6种常见呼吸道病毒核酸检测。对腺病毒核酸阳性的标本,用腺病毒六邻体基因作为靶基因进行序列扩增及测定,测序结果在GenBank 上进行序列比较,确定其病毒亚型并进行系统进化分析。结果 疫情发生在二年级（1）班,全班共54名学生,男29名,女25名。经调查该学校其他班级其余年级未出现相同症状病例。该起疫情共发现病例13例,其中男生7例,女生6例,男女学生罹患率分别为24.1%( 7 /29) 和24.0% ( 6 /25) 。临床特征为发热13例(100.0%),咽痛8例( 61.5%),全身肌肉酸痛8例( 61.5%),咳嗽5例(38.5%),症状均较轻,无重症病例。共采集5份咽拭子标本,经荧光定量PCR检测均为腺病毒核酸阳性,5份标本用分型引物检测并分析序列确定均为腺病毒E亚属4型。结论 此次急性呼吸道感染聚集性疫情由腺病毒4型引起,毒株序列与深圳其他区、国内其他城市分离的腺病毒4型毒株序列具有高度同源性。     

儿童肺泡灌洗液肺炎支原体检出率及基因型分析

目的检测136例儿童肺泡灌洗液标本感染肺炎支原体（MP）的情况并初步了解安徽合肥地区MP基因型情况。方法采用普通PCR技术从136例儿童的肺泡灌洗液标本筛查出已感染MP的标本,并通过巢式多重PCR技术对MP阳性标本进行基因型分析,对照试验采用FH-MP标准株为DNA模版。巢式多重PCR扩增后的DNA片段构建T载体重组质粒做基因测序验证。结果普通PCR检测显示有52例MP阳性标本（136例肺泡灌洗液标本）。巢式多重PCR技术检测显示MP阳性标本基因型均为P1-Ⅰ型,而标准株FH-MP的基因型为P1-Ⅱ型。重组质粒经过测序后进行片段对比验证其扩增条带均正确。结论合肥地区儿童MP流行株基因型为P1-Ⅰ型,感染MP的阳性率为38.2%。     

北京市西城区2013年输入性麻疹病毒D8基因型流行分析

目的通过开展疑似麻疹病例的病原学标本核酸检测,加强麻疹病毒基因型的监测。方法采集2013年北京市西城区疑似麻疹病例41例的咽拭子和尿液标本共47份,采用荧光PCR方法对麻疹疑似病例病原学标本进行病毒核酸检测鉴定,RT-PCR扩增核酸阳性标本N基因部分序列,并对扩增产物测序。以N基因末端450个核苷酸序列进行基因亲缘性分析,利用MEGA 4软件进行系统发生树的构建。结果经过序列分析比对,47份标本中获得的21份序列中有5份为D8基因型,其他均为H1基因型。所获得的5株麻疹D8基因型毒株序列与世界卫生组织(WHO)D8基因型代表株MVi/Manchester.UNK/30.94在基因亲缘性关系树上同属一个分支,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.0%和98.7%。结论 2013年北京市西城区麻疹病例出现了输入性麻疹病毒D8基因型的流行。     

一起聚集性肺炎疫情病原的快速实验室诊断与分析

目的:通过实验室病原学检测,结合流行病学史及临床表现,初步筛查疫情致病病原体。方法:采集患者咽拭子标本,分别采用荧光PCR方法检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体基因。结果:11份患者咽拭子中有4份标本荧光PCR扩增支原体基因阳性,1份为弱阳性。所有标本的甲、乙型流感荧光PCR扩增结果为阴性。同时采集与患者同班的3例无症状对照标本,3例标本的肺炎支原体DNA检测均为阴性。结论:实验室研究结果并结合此次疫情的流行病学和患儿的临床表现,初步判断可能是一起由肺炎支原体引起的聚集性支原体肺炎疫情。     

输入性登革热的实验室诊断

目的通过实验室检测发现并确诊1例输入性登革热阳性病例。方法采用实时荧光(RT-PCR方法对病人血清进行检测,并对RT-PCR扩增产物进行核苷酸序列测定,检测结果使用BLAST进行比对;并采用间接ELISA法和捕获ELISA法分别检测登革热特异性抗体IgG、IgM。结果通过实时荧光RT-PCR方法检测出该病例呈登革热病毒核酸Ⅲ型阳性;对RT-PCR扩增产物进行序列比对,结果显示与登革病毒III型同源性很好;ELISA法检测登革热特异性抗体IgG、IgM均为阴性。结论通过实验室确诊,该病例为登革热阳性病例。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

宁夏地区黄牛博尔纳病病毒自然感染状况的探讨

目的 了解宁夏地区黄牛博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)的自然感染情况,对检测到的BDV p24基因阳性扩增片段进行核苷酸序列比对,探讨其与国际标准病毒株及其分离株的同源性.方法 采用荧光定量巢式逆转录酶聚合酶链反应(FQ-nRT-PCR)检测宁夏地区205例健康牛外周血单个核细胞(PBMCs)BD-Vp24基因片段,并对其中的阳性扩增产物进行基因序列测定,然后应用BLAST软件以及DNAsist 5.0软件对测序结果分析.结果 205例中3例阳性,阳性率为1.5%;该BDVp24片段的核苷酸序列与Strain H3915同源性最高达97.67%,与标准病毒株H1766同源性为96.51%,与Strain V/FR的同源性为95.35%,且它们编码的氨基酸相同.结论 宁夏地区黄牛中存在动物源性BDV的自然感染,该BDV p24核苷酸序列与标准病毒株具有高度同源性.     

东莞市2015—2016年柯萨奇病毒A6型流行情况及特征分析

目的 研究东莞市2015—2016年手足口病(HFMD)病例中柯萨奇病毒A6型(CVA6)的流行情况及基因特征。方法 采用RT-PCR方法对HFMD疑似病例标本进行检测,CVA6阳性标本上送广东省疾病预防控制中心,进行病毒分离及鉴定,扩增并测定VP1基因序列。从GenBank中选取其他CVA6代表株进行参考比对,利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4.0.2软件构建亲缘性进化树。结果 在1 145份标本中检出CVA6阳性标本580份,阳性率为50.66%(580/1 145)。序列比对显示,20株CVA6分离株VP1基因之间核苷酸同源性为93.6%~100.0%,氨基酸同源性为97.7%~100.0%。东莞市CVA6分离株VP1与近年来全球各地流行株核苷酸和氨基酸的同源性分别为93.4%~98.5%和97.0%~99.7%,与CVA6原型株Gdula以及我国山东省1996年分离株核苷酸和氨基酸相似性仅为82.5%~85.8%和94.1%~96.4%。系统进化树分析显示,2015—2016年东莞地区CVA6与近年来流行于世界各地的CVA6分离株同源性较高,而与原型株进化距离较远。结论 2015—2016年东莞市HFMD病原以CVA6为主,流行株为近年来流行于全国各地的CVA6新变种。     

基于聚合酶区和衣壳区测序的诺如病毒暴发疫情溯源

目的 分析一起厨工相关诺如病毒暴发的病原学特征,为诺如病毒感染的溯源提供证据.方法 利用Fil-marray病原体检测系统初筛,根据感染性腹泻诊断标准WS 271-2007进行细菌分离,同时进行诺如病毒荧光PCR检测,对诺如病毒阳性核酸进行聚合酶区和衣壳区序列扩增,测序比对,利用Mega软件分析同源性.结果 49份患者...     

重庆地区2009年手足口病病原分离鉴定及病毒基因组特征

目的 对2009年重庆市手足口病(hand-foot-mouth disease, HFMD)患儿粪便标本的病原进行分离鉴定及全基因组序列测定,并同相关毒株序列进行同源性比对和进化分析,以了解新分离病毒基因组序列特征及可能的传播来源.方法 将47例手足口病患儿临床标本接种人横纹肌肉瘤细胞(human rhabdomyosarcoma,RD)进行分离培养,采用EV、EV71、Cox A16特异性引物对出现细胞病变的细胞上清进行PCR鉴定,同时电镜观察病毒颗粒形态,将鉴定的病毒基因组分为4个片段进行RT-PCR扩增,扩增产物纯化后进行PCR测序.通过末端重叠序列拼接成全长病毒基因组序列,利用生物信息学软件对序列进行比对分析,绘制进化树.结果 在47例HFMD患儿临床标本接种RD细胞培养中,有7份观察到明显的细胞病变,通过RT-PCR检测有3份呈EV特异性引物及EV71特异性引物阳性,而所有标本Cox A16特异性引物检测为阴性,EV71特异性引物的PCR产物测序结果证实为EV71病毒,同时用电镜观察形态病毒感染的RD细胞,为圆形无包膜病毒颗粒,证实所分离病毒为EV71.测序获得的3株EV71病毒基因组全长分别为7 409、7 406 nt和7 404 nt,其VP1氨基酸序列同源性达99%以上.Blast分析表明重庆毒株Chongqing-2-09-China(GQ994990.1)、Chongqing-3-09-China (GQ994991.1)均与安徽阜阳2008年分离的3株EV71毒株同源性较高,重庆毒株Chongqing1-09-China (GQ994989.1)与2005年台湾分离984 polyprotein、1235 polyprotein序列毒株同源性最高,进化分析表明属于C4基因亚型.结论 新分离的重庆EV71毒株基因组序列符合肠道病毒特征,与国内2008年安徽阜阳及台湾2005年分离的EV71病毒可能具有相同来源.     

2011-2012年深圳市呼吸道腺病毒分子分型及其流行特征

目的了解2011-2012年深圳地区致病性呼吸道腺病毒(AdV)的病原体基因亚型和遗传进化及其流行特征,分析深圳地区呼吸道腺病毒的流行规律和传播途径。方法收集2011年1月至2012年12月深圳地区31个流感样病例监测哨点2 822份样本,先用荧光定量PCR方法筛查流感样病例,筛查后的阴性样本进一步进行呼吸道腺病毒等13种常见呼吸道病毒的核酸检测。对检测出的109份腺病毒阳性标本进行病毒分离,感染Hep-2受体细胞后共获得71份AdV稳定细胞毒株,用腺病毒六邻体基因作为靶基因,扩增其中的50份腺病毒阳性标本,纯化扩增产物后直接用于序列分析,在GenBank上进行序列比较,确定其病毒亚型并进行系统进化分析。结果 2011-2012年深圳市腺病毒感染患者的高发年龄段人群为小于7岁的儿童,1~2岁婴幼儿发病率最高;4-6月和10-12月为每年发病高峰期。在2 822份流感样病例咽拭子标本中,经定量PCR方法确定为AdV核酸阳性共109份,核酸阳性率为3.86%,从109份核酸阳性样本中分离病毒71份,病毒分离率为68.93%。50份分离的呼吸道腺病毒分子分型结果为1型AdV 6例,占12%;2型AdV 4例,占8%;3型AdV 27例,占54%;4型AdV 3例,占6%;5型AdV 4例,占8%;7型AdV 5例,占10%;另外有复合型AdV(HAdV-un)1例,占2%。结论近两年来深圳地区呼吸道Adv感染以3型为主,腺病毒引起的呼吸道疾病主要发生在每年的4-6月,感染人群主要是1~2岁婴幼儿。     

肺炎衣原体ELISA抗原检测方法的建立和应用

目的 采用ELISA技术,建立肺炎衣原体抗原检测方法.方法 建立酶联免疫吸附法,检测标本中的肺炎衣原体.采用常见的呼吸道病原体进行特异检测.对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.结果 本方法对流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应.对本院的临床样本检出13份,其中咽拭子4份,肺泡冲洗液9份.结论 本肺炎支原体抗原检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断.     

东莞市1例星状病毒核酸检测及分析

目的对星状病毒进行核酸快速诊断并对其部分核酸序列进行测序分析。方法采用RT-PCR、基因测序技术对标本中的核酸进行检测分析。结果 RT-PCR结果表明标本为星状病毒阳性,对PCR扩增产物测序得到了409bp长度的ORF2部分基因序列,经Blast比对发现其为Ⅰ型血清型,与北京分离的一株星状病毒序列（GenBank号FJ755403.1）最为相似,仅有一个C→T的核苷酸变异。但编码的氨基酸并无改变,均为甘氨酸（Gly）。结论应用PCR技术扩增星状病毒特定片段可用于病毒的快速检测,同时对扩增产物测序还可对病毒进行分型,并了解其基因变异情况。