感染CDV的犬病料N、H、F基因的克隆与序列分析

目的 了解病料中犬瘟热病毒(CDV)的变异情况,为犬瘟热的预防与治疗提供理论依据.方法 采用RT-PCR方法对犬病料中CDV的血凝素蛋白(H)、融合蛋白(F)和核农壳蛋白(N)基因进行扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T-easy载体中测序,并进行序列分析.结果 测定一株CDV的H、F和N基因大小分别为1863 bp、1653 bp和2235 bp.同源性分析表明,未发现碱基的插入和缺失.该病毒的H、F和N基因分别与国内强毒株BJ080127株的H基因、GN株的F基因和HL株的N基因亲缘关系最近,氨基酸同源性分别为97.3%、97.7%和99.3%.与国外标准野毒株A75-17在核苷酸水平上同源性依次为94.4%、93.8%和97.2%,与疫苗株CDV3在核苷酸水平上同源性分别为88.5%、88.8%和93.9%.系统进化树表明该病毒与国内强毒株在同一谱系.糖基化分析显示,该病毒在F基因3～5位氨基酸处多出1个糖基化位点.结论 本研究从犬病料中成功克隆了犬瘟热病毒血凝素蛋白、融合蛋白和核衣壳蛋白,在F基因中新增了一个糖基化位点,为犬瘟热的遗传变异和流行学研究提供了分子生物学依据.     

狂犬病病毒糖蛋白在大肠埃希菌中的表达及鉴定

目的 表达狂犬病病毒糖蛋白(GP),用于狂犬病疫苗免疫抗体评估和狂犬病病毒糖蛋白功能的研究. 方法 采用分析软件,分析其可能的抗原表位,利用PCR方法 扩增狂犬病病毒SRV9疫苗株G蛋白抗原位点区域基因,PCR产物经EcoRI和SalI双酶切后,插入大肠埃希菌表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a.将重组质粒转化大肠埃希菌BL21感受态细胞中,在IPTG诱导下表达目的 蛋白,进行SDS-PAGE分析.表达蛋白进行电洗脱纯化和Western blot鉴定分析.结果 成功构建了pGEX-6P-1/G87a和pGEX-6P-1/G100a表达质粒,序列分析表明,插入片段大小分别为1314 bp和1275 bp.SDS-PAGE分析结果 证明,在大肠埃希菌系统中成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达的融合蛋白含有GST标签,大小分别约为74×103和73×103.Western blot鉴定结果 表明,表达产物有抗原特异性并能与狂犬病病毒抗血清反应.结论 利用大肠埃希菌表达系统成功表达了狂犬病病毒部分糖蛋白,表达产物有良好的反应原性.     

牛γ-干扰素在大肠杆菌中的表达及抗原性鉴定

目的 在大肠杆菌中高效表达牛γ-干扰素(bovine interferon-γ,BovIFN-γ),并对其生物活性进行初步鉴定.方法 依据GenBank上基因序列人工合成BovIFN-γ基因,PCR方法扩增该基因,将其插入PET-28a载体构建原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21中,在IPTG诱导下表达BovIFN-γ,并进行Western blot鉴定.Ni-NTA亲和层析法和电洗脱方法纯化表达的重组蛋白,用Western blot和商品化的BovIFN-γ检测试剂盒进行重组蛋白的抗原性检测.结果 成功构建了BovIFN-γ原核表达载体PET-28a- BIFN-γ,并在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的32％,表达产物主要以可溶性形式存在于菌体裂解液上清中;重组蛋白可与BovIFN-γ单克隆抗体反应,Ni-NTA亲和层析法纯化的重组蛋白抗原活性比电洗脱方法纯化的抗原活性高.结论 在大肠杆菌中成功表达了可溶性的BovIFN-γ蛋白,可与BovIFN-γ单抗发生反应,纯化的重组蛋白具有良好的反应原性.     

猪伪狂犬病毒gB基因在大肠杆菌中的分段表达

目的 分段表达伪狂犬病毒( pseudorabies virus,PRV)gB基因,用于PRV疫苗免疫抗体评估试剂盒研究.方法 分析gB抗原表位,设计4对特异性引物,从PRV新疆分离株中扩增gB基因的4个片段,分别命名为gB-1、gB-3、gB-4和gB-5基因,克隆到pGEM-T-easy载体并测序.再将4个gB基因片段融合到pGEX-6P-1原核表达载体中,表达并纯化.Western Blotting进行重组蛋白的抗原性检测.以纯化的重组蛋白为抗原建立间接ELISA方法,检测猪血清临床样品.结果 构建的4种表达质粒均可在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE分析,表达分子量分别为75.05、53.86、49.96和49.72×103Da,其中gB-3、gB-4和gB-5表达量较高,表达产物主要存在于包涵体中.Western Bloting鉴定显示,4种融合蛋白均可被猪伪狂犬阳性血清特异识别.以gB-3、gB-4和gB-5建立的ELISA方法与IDEXX公司的gB-ELISA试剂盒符合率分别为40.9％、81.8％和81.8％.结论 本研究成功表达了PRV的gB-1、gB-3、gB-4和gB-5重组蛋白,gB-3、gB-4和gB-5表达量较高;其中以gB-4和gB-5建立的间接ELISA方法与IDEXX公司的符合率较高.