抗人蛋白酶激活受体4单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人蛋白酶激活受体4(PAR4)单克隆抗体(mAb).方法:以hPAR4为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR4 mAb.采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig类型,采用ELISA、点杂交、免疫组化染色法(人结肠、扁桃体及包皮组织)、流式细胞术、激光共聚焦显微镜(CLSM)技术鉴定mAb的特异性.结果:获得3株可稳定分泌抗PAR4 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM.免疫组化染色表明,mAb将人结肠组织中的腺上皮细胞、疑似肥大细胞和淋巴细胞,扁桃体组织中的淋巴细胞和包皮组织中的肥大细胞染成褐色.流式细胞术分析显示,3株mAb与A549细胞的PAR4均呈阳性反应.CLSM观察发现,荧光标记的阳性反应物主要位于A549细胞的胞质和胞膜上.结论:成功制备了抗PAR4 mAb,为进一步的研究工作提供了有用的试剂.     

抗人蛋白酶激活受体3单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备并鉴定抗人蛋白酶激活受体3(PAR3)单克隆抗体(mAb).方法:以人PAR3为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR3 mAb.采用捕获ELISA法鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术、免疫组织化学染色法、斑点杂交技术鉴定mAb的特异性.结果:获得2株可稳定分泌抗人PAR3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM.斑点杂交技术分析表明,其mAb能与PAR3抗原有效结合.免疫组织化学染色表明,mAb与肺组织中的巨噬细胞、结肠组织中的淋巴细胞及疑似肥大细胞、扁桃体和包皮组织中的淋巴细胞的反应呈阳性.流式细胞仪分析及激光共聚焦显微镜观察显示,2株mAb与人肺腺癌A549细胞胞内及膜上的PAR3均呈阳性反应.结论:成功地制备抗PAR3 mAb,为变态反应性和炎症性疾病的研究提供了有用的试剂.     

抗人白介素-28A单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人白介素-28A（hIL-28A）单克隆抗体（mAb）。方法以hIL-28A融合蛋白为免疫原免疫BALB／c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗hIL-28A mAb。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,通过ELISA、Western blot、免疫组化染色法、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得2株稳定分泌抗hIL-28A mAb的杂交瘤细胞,但2株mAb均与hIL-29有弱交叉反应。2株mAb的类别均为IgM。Western blot分析表明,此mAb所识别的靶分子的相对分子质量（Mr）约为19000。免疫组化染色表明,mAb与包皮和肺组织中的上皮细胞、结肠组织中的疑似巨噬细胞呈阳性反应。流式细胞仪分析显示,2株mAb与人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞的反应均呈阳性。激光共聚焦扫描显微镜观察到荧光标记的阳性反应物主要位于HUVEC细胞胞浆内。结论成功地制备抗hIL-28A mAb,为病毒感染性疾病、肿瘤和其他疾病的研究提供新的手段。     

抗人DR5功能性抗体的研制

目的:研制抗人DR5功能性单克隆抗体。方法:采用杂交瘤技术制备抗人DR5的mAb;MTT方法筛选分泌有细胞毒活性mAb的杂交瘤细胞;亲和层析方法纯化mAb;夹心ELISA法测定mAb亚型;Western blotting和斑点ELISA法检测mAb的抗原表位类型;间接ELISA法检测mAb的特异性;观察抗体诱导细胞凋亡的形态学特征。结果:获得1株合成分泌有细胞毒活性抗体的杂交瘤细胞,其分泌的mAb命名为mDRA-6,为Ig G1,其抗原表位类型为构象表位,其特异性识别hDR5,与hFas、hDR4等无交叉反应。mDRA-6对Jurkat细胞具有细胞毒作用,经mDRA-6处理后,Jurkat细胞表现出细胞凋亡的形态学特征。结论:获得一种抗人DR5功能性抗体mDRA-6,在以TRAIL/DR5系统进行肿瘤治疗和探讨DR5的功能结构域研究方面具有广泛应用前景。     

抗人hER单克隆抗体的制备及其应用

目的:制备抗人hER单克隆抗体。方法:用原核表达的人雌激素受体(hER)重组蛋白为抗原,免疫BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,进行细胞融合。结果:通过ELISA和免疫组织化学法筛选,有限稀释克隆化,得到一株分泌抗hER单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2B8/1C5/2C3),经鉴定2B8/1C5/2C3分泌的单克隆抗体为IgG2a,利用Western Blot分析,显示在23kU处针对hER重组蛋白位置有一特异性条带;利用乳腺癌组织进行的免疫组织化学染色结果显示该株细胞产生的单克隆抗体与细胞核呈强阳性反应。结论:该单克隆抗体适于乳腺癌组织hER的免疫组化检测。     

人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定

目的 应用杂交瘤技术,制备鼠抗人OX40单克隆抗体.方法 以本室纯化的OX40胞外段融合蛋白免疫6～8周龄的雌性BalB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞阳性克隆.用杂交瘤细胞接种小鼠腹腔诱生腹水,腹水经饱和硫酸铵纯化沉淀后用间接ELISA法测定抗体的Ig类别.SDS-PAGE分析抗体的纯化程度,用免疫组化技术鉴定单克隆抗体与表达有OX40分子的组织及细胞特异性结合的情况.结果 获得1株能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞,细胞株诱生的小鼠腹水纯化后抗体纯度较高,Ig类别为IgG,蛋白浓度为6.129g/L.制备的单抗经淋巴细胞免疫组化及炎性淋巴组织免疫组化技术初步鉴定结果表明,该抗体与OX40单克隆抗体标准品制剂相比具有类同的特异性.结论 成功获得能稳定分泌鼠抗人OX40单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备的单克隆抗体具有较高的纯度和活性.     

SARS冠状病毒单克隆抗体制备及在肺尸检标本染色中的应用

目的制备抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,用于SARS的实验室诊断。方法灭活SARS冠状病毒(PUMC01)全病毒免疫BALB／C小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、间接免疫荧光法(IFA)及免疫印迹法对所获得的细胞克隆进行筛选和鉴定,并用其中一株(M2)杂交瘤诱生的腹水单克隆抗体对SARS患者尸检肺组织切片进行免疫组织化学染色。结果共筛选出6株杂交瘤细胞,ELISA及IFA法证实其分泌的单克隆抗体与SARS冠状病毒有特异性反应,与其他常见呼吸道病原体均无交叉反应。免疫双扩散方法鉴定1株杂交瘤细胞(M2)为免疫球蛋白IgG3型,其余5株均为IgG1型。免疫印迹试验显示1株杂交瘤细胞(M2)分泌的抗体与相对分子质量68000的蛋白有特异性反应;4株杂交瘤细胞分泌的抗体与相对分子质量27000的蛋白有特异性反应,1株在免疫印迹上未见到结果。SARS患者尸检肺组织病理切片免疫组织化学染色阳性,在肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞及巨噬细胞的胞浆均可见阳性颗粒。结论我们制备的6株单克隆抗体是抗SARS冠状病毒的特异性单克隆抗体,用于SARS尸检肺组织免疫组化染色,结果阳性。     

抗HBsAg单克隆抗体的制备与生物学特性的鉴定

目的:制备分泌抗HBV S蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并鉴定其特性,为建立快速诊断HBV感染的方法奠定基础.方法:以重组乙肝疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合建立了能稳定分泌抗HBsAg单抗的杂交瘤细胞株,利用间接ELISA技术和Western blot进行单抗特异性的鉴定,同时采用间接ELISA方法鉴定mAb的Ig亚类,检测mAb的效价及相对亲和力.结果:获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞4D2,其抗体亚类为IgG1型,腹水效价为1:10(6),相对亲和力在10(5)以上.结论:成功地制备出抗HBV S蛋白的单克隆抗体,为建立快速特异检测HBV感染的实验方法提供了有力的工具.     

抗HBV末端蛋白杂交瘤细胞系的建立及其单克隆抗体鉴定

目的：制备分泌抗乙型肝炎病毒末端蛋白mAb杂交瘤并研究杂交瘤细胞及所产生抗体的特性．方法：用经原核表达的乙型肝炎病毒末端蛋白(HBV-TP)免疫BALB／c小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／O融合，经筛选和克隆化建立杂交瘤细胞系，然后用ELISA法筛选出阳性克隆，以免疫组化ABC方法研究杂交瘤细胞分泌的mAb特性．结果：共筛选出3株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系，其杂交瘤细胞经过100d连续培养，mAb分泌稳定，特异性强，腹水抗体效价免疫组化ABC法1：1000。免疫组化检测显示其相应抗原在肝炎及肝硬变组织中呈高表达(80％)，正常肝组织中未见阳性反应；其抗原主要分布于细胞质内．结论：此3株抗乙型肝炎病毒末端蛋白杂交瘤细胞分泌的mAb具有特异亲合性，其成功制备为研究HlBV感染的早期诊断及乙肝患的生物治疗奠定了基础。     

抗HBV逆转录酶杂交瘤细胞系的建立及其单克隆抗体鉴定

目的 建立抗乙型肝炎病毒逆转录酶单克隆抗体杂交瘤并研究杂交瘤细胞及抗体特性。方法 用经原核表达的乙型肝炎病毒逆转录酶蛋白（HBV-RT）免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合,经筛选和克隆化制备杂交瘤细胞系,然后用ELISA法筛选出阳性克隆,最后用免疫组化ABC方法研究杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体特性。结果 2株能持续、稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其杂交瘤细胞经过100d连续培养,单克隆抗体分泌稳定,特异性强、腹水抗体效价免疫组化ABC法1：1000。免疫组化检测显示其相应抗原在肝炎及肝硬变组织中呈高表达（73%）,正常肝组织中未见阳性反应;其抗原主要分布于细胞质内。结论 此2株抗乙型肝炎病毒逆转录酶杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有特异亲合性,它们的成功制备为研究HBV感染的早期诊断及乙肝患的治疗奠定了基础。     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.     

重组人L型丙酮酸激酶N末端单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人L型丙酮酸激酶N末端(PK-N)的单克隆抗体并对其特异性进行鉴定.方法 以PK-N-GST-tag表达蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/O细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立能稳定分泌抗PK-N单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA、Western blot、免疫组化对此单克隆抗体特性进行鉴定.结果 筛选到两株能稳定分泌抗PK-N单克隆抗体的细胞株,亚类鉴定重链为IgGzb,轻链为kappa链.ELISA法测定腹水效价分别为1:409600和1:102400,抗体相对亲和力分别为3.54×108L/mol和2.72×108:L/mol.Western blot显示抗体能特异识别免疫原和人肝细胞株HL-7702中的天然丙酮酸激酶蛋白.免疫组化进一步显示了其在细胞及组织中的定位,均匀的分布于细胞的胞浆中.结论 成功制备了抗PK-N单克隆抗体.     

抗hMOF单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗hMOF的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-hMOF融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗hMOF单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA、Western blot、免疫组化对此抗体特性进行鉴定.结果 筛选到1株能稳...     

抗人胰岛素样生长因子-1单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备稳定分泌抗人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的mAb进行鉴定.方法:用纯化后的hIGF-1重组蛋白免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术制备抗hIGF-1的mAb,用Western blot法鉴定mAb的特异性,用间接ELISA法检测mAb腹水效价及mAb的亲和力,杂交瘤细胞染色体分析,鉴定Ig亚类.结果:获得2株能稳定分泌抗hIGF-1的mAb杂交瘤细胞系,Western blot分析显示,该mAb能与具有生物学活性的成熟IGF-1蛋白结合.腹水mAb效价可达6×104.mAb相对亲和力为2.1×109/mol～7.8×109/mol.2株单抗属IgM亚类.染色体分析符合杂交瘤细胞特征.结论:成功制备出抗hIGF-1的2株mAb杂交瘤细胞,为进一步用于hIGF-1的临床检测和实验研究创造了条件.     

抗人SOCS3单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的 制备高效价的抗人SOCS3单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定.方法 以重组GST-SOCS3融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可稳定分泌抗SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.用ELISA及Western blot鉴定单克隆抗体的特性,并测定其效价、Ig亚类及相对亲和力.结果 筛选到一株可稳定分泌抗人SOCS3单克隆抗体的杂交瘤细胞株.Western blotting显示在相对分子质量为6.3×104处出现特异性反应带.杂交瘤细胞培养上清效价为1:640,腹水效价为1:25600,Ig亚类为IgG2a,相对亲和力达4.84×106 L/mol.结论 成功制备能特异性识别人SOCS3的单克隆抗体,为进一步研究人体细胞因子信号传导的负反馈调节及SOCS3在微生物感染中的免疫调节作用奠定了基础.     

抗金葡菌多肽单克隆抗体制备及初步鉴定

目的:研制抗金葡菌多肽单克隆抗体(mA b)。方法:抗金葡菌多肽(PH-SA)抗原采用脾内注射、醋酸纤维膜皮下包埋、完全佐剂3种方法免疫Balb/C小鼠,常规方法细胞融合,用EL ISA间接法筛选阳性细胞并测定相对亲和力,双抗体竞争试验和双抗体竞争抑制试验识别PH-SA表位。结果:获4株可分泌PH-SA mA b的杂交瘤细胞株。免疫球蛋白亚类测定均为小鼠IgG1亚类,相对亲和力依次为G11>B9>H3,4株mA b可能抗相同抗原表位。结论:获4株PH-SA mA b的杂交瘤细胞株为PH-SA的鉴定提供了可能性。     

抗EB病毒LMP2A单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性?方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体?通过ELISA?Western blot?免疫荧光?免疫组化?流式细胞术等方法鉴定单抗的免疫学特性?结果:获得1株稳定并持续分泌抗LMP2A单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体5C12-C4-A6 能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面的LMP2A蛋白?结论:本文制备了能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面LMP2A蛋白的单克隆抗体,为进一步进行鼻咽癌临床早期诊断和分子靶向治疗奠定了基础?     

抗CLCN5单克隆抗体的制备及鉴定

目的：制备抗氯离子通道蛋白5（CLCN5）单克隆抗体（mAb）并对其进行鉴定。方法：用人CLCN5为抗原免疫BLAB／c小鼠，用常规方法进行细胞融合，经筛选及克隆化建立可稳定分泌抗CLCN5 mAb的杂交瘤细胞株；用ELISA及Western blot进行抗体的鉴定。结果：筛选到4株可稳定分泌抗CLCN5 mAb的细胞株；Western blot显示，在4株抗体中有1株在相对分子量为83kDa处出现1条特异性条带．说明该单克隆抗体可与HSG胞浆蛋白中的CLCN5蛋白特异性地结合。结论：本实验成功获得1株可特异性识别CLCN5的单克隆抗体细胞株，可用于肾结石、X-连锁综合征的进一步研究、临床诊断及相关试剂盒等的开发研制。     

抗FLT3受体单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗FLT3受体的单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以PET46-FLT3-His-tag表达蛋白作为免疫原免疫BALB／C小鼠,取其脾细胞与SP2／0细胞融合,经多次筛选及克隆化,建立可以稳定分泌抗FLT3受体的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA、Western blot、免疫组化对此抗体特性进行鉴定。结果筛选到两株能稳定分泌抗FLT3受体单克隆抗体的细胞株5F381181和D3H2C12,亚类鉴定两种单抗为IgG1,ELISA法测定两株细胞腹水抗体效价分别为1：409600和1：102400,抗体相对亲和力为7．85×10^6L／mol。Western blot显示抗体能特异识别免疫原。细胞免疫组化显示此单抗可以特异的识别急性髓系白血病病人骨髓中原始细胞表达的FLT3受体。结论成功制备抗FLT3受体单克隆抗体,为进-步研究其与白血病等血液疾病的关系奠定了基础。     

抗人滋养层细胞表面抗原-2单抗的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗人滋养层细胞表面抗原-2(trophoblast cell-surface antigen 2,Trop2)单克隆抗体并鉴定其免疫学特性?方法:以胰腺癌细胞系BxPC3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合后制备单抗?通过酶联免疫法?免疫荧光?免疫沉淀和质谱分析?流式细胞术?免疫组织化学等方法,鉴定单抗的免疫学特性?结果:通过细胞的融合与筛选,获得了持续分泌抗Trop2单抗的杂交瘤细胞株,该抗体可以识别细胞表面的Trop2膜蛋白,也可用于免疫组化识别人肿瘤组织中的Trop2蛋白,同时该抗体对乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制作用?结论:该单抗具有作为Trop2阳性表达肿瘤靶向治疗的潜在应用价值?