TNF-α基因转染增强树突细胞迁移及CCR7受体表达

为探讨腺病毒介导肿瘤坏死因子－α（TNF－α）基因转染诱导树突细胞（DCs)趋化因子受体差异性表达，分别用100MOI的AdV-TNF－α和AdV-pLpA(无外源基因插入）感染小鼠树突细胞（mDCs)，经流式细胞仪检测细胞表型变化，RNA酶保护实验检测其趋化因子受体表达，体内、体外细胞趋化试验分析比较其迁移差异。发现AdV-TNF－α感染mDCs后CD11b、CD40、CD86、ICAM－1以及CC7授 体表达较对照组明显增高，CCR2受体表达量却下调；体外细胞趋化试验表明DCTNF－α对MIP－3β（CCR7配体）迁移应答增强，体内细胞趋化试验显示DCTNF－α淋巴结趋化迁移效率较空白对照组和AdV-pLpA感染组分别增高7倍和3倍。提示：AdV-TNF－α感染促使mDCs成熟，增强其次级淋巴结趋化迁移效率。     

趋化因子受体CCR7促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭

目的:研究趋化因子受体CCR7的表达对乳腺癌细胞趋化活性与侵袭活性的促进作用.方法:RT-PCR法测定3株乳腺癌细胞MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-361中CCR7的表达;在CCR7的配体SLC作用下,通过趋化小室法检测不同乳腺癌细胞的趋化活性与侵袭活性;检测CCR7的封闭对乳腺癌细胞趋化活性和侵袭活性的影响. 结果: 3株乳腺癌细胞中均存在不同程度CCR7的表达,其配体SLC对3种乳腺癌细胞均存在不同程度的趋化活性和侵袭活性,CCR7的封闭也能够在不同程度上抑制乳腺癌细胞的这种趋化活性和侵袭活性. 结论: 趋化因子受体CCR7的表达能够促进乳腺癌细胞的趋化与侵袭,从而可能在乳腺癌细胞向淋巴结转移中发挥重要作用.     

病毒性心肌炎中树突状细胞的体内迁移过程及其机制

目的免疫反应参与病毒性心肌炎(VMC)的发生、发展,前期研究发现树突状细胞(DCs)在病毒感染的心肌炎症组织中数量增多,本研究旨在通过研究VMC中DCs的体内迁移过程,进而探讨趋化因子在DCs迁移机制中的作用。方法雄性Balb／c小鼠140只,体质量约16-20 g,随机分为正常对照组60只和VMC组80只。VMC组小鼠腹腔注射柯萨奇B组病毒(CoxB3),滴度为1×105TCID50／0．1 mL,正常对照组小鼠腹腔注射等容积不含病毒的EMEM液。应用反转录-聚合酶链反应检测心肌组织中DCs相应的趋化因子受体CCR5、CCR7的表达变化和趋化因子MIP-1β、MIP-3β的表达变化以及脾脏中CCR7和MIP-3β的表达变化:从小鼠的骨髓中分离诱导培养DCs,经光学显微镜、电子显微镜和Giemsa染色鉴定后,应用趋化实验在体外分析DCs对MIP-1β、MIP-3β的趋化反应。结果与正常对照组相比, VMC组心肌组织中趋化因子受体CCR5和CCR7表达增加,且局部趋化因子MIP-1β和MIP-3β表达也增加(P值均<0．05),脾脏中CCR7和MIP-3β表达增加(P值均<0．05);VMC组骨髓来源的DCs对趋化因子MIP-1β、MIP-3β的趋化反应能力增强(P值均<0．05)。结论骨髓来源的不成熟DCs表达CCR5、CCR7,分别在心肌局部的MIP-1β、MIP-3β趋化作用下迁移至心肌病变部位,并且逐渐演变为成熟DCs,同时高表达CCR7,在脾脏MIP-3β趋化作用下迁移至脾脏T细胞区引发适应性免疫反应;病毒组DCs的趋化作用明显强于正常对照组。因此,病毒感染心肌后DCs逐渐成熟,引发趋化因子表达增高,进而使心肌组织中炎症细胞聚集,导致心肌细胞坏死,出现临床心肌炎的表现。     

STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达中的作用

目的 探讨STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞(human monocytederived dendritic cells,moDCs)趋化因子受体7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)表达中的作用.方法 采用CD14+磁珠分离法从外周血中分离得到单核细胞,加入rhGM-CSF和rhIL-4在体外诱导培养树突状细胞.LPS用于刺激moDCs表达CCR7,RT-PCR检测不同浓度IL-6处理后再用LPS刺激后的moDCs CCR7 mRNA表达.Western blot检测IL-6处理moDCs和IL-6预处理后再加入STAT3磷酸化特各异性抑制剂JSI-124的moDCs STAT3、p-STAT3表达.IL-6预处理并抑制STAT3磷酸化后,LPS刺激48 h,RT-PCR检测moDCs CCR7 mRNA的表达,流式细胞仪检测moDCs CCR7蛋白表达,细胞迁移实验检测moDCs细胞迁移功能.结果 与单独LPS刺激组比较,IL-6明显抑制LPS刺激的moDCs CCR7mRNA的表达(P＜0.05).Western blot结果显示,与单独LPS刺激组比较,IL-6导致moDCs细胞内STAT3高度活化;而抑制STAT3信号高度活化后,与IL-6+LPS处理组比较,moDCs CCR7 mRNA表达、蛋白分子表达、细胞迁移能力明显升高(P＜0.05),与LPS刺激组无差异(P＞0.05).结论 IL-6通过高度活化STAT3信号通路抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达,导致树突状细胞的迁移能力受损,而靶向干预STAT3通路可能成为纠正树突状细胞迁移障碍的潜在手段.     

趋化因子受体CCR7介导树突状细胞抗凋亡机制研究

目的研究趋化因子受体CCR7对成熟树突状细胞（DCs）的抗凋亡作用，并对其机制进行探讨。方法体外培养大鼠骨髓来源DCs，脂多糖诱导成熟。加入CCR7配体CCL21进行刺激，以不加CCL21为对照组，流式细胞术检测细胞凋亡率，Western blot检测磷酸化Akt、Akt蛋白表达，应用Wortmannin抑制PI3K/Akt信号通路进一步观察磷酸化Akt蛋白表达和细胞凋亡的变化。结果在CCL21的作用下，DCs细胞凋亡率明显低于对照组，而磷酸化Akt蛋白表达却明显增高（P〈0.05）。DCs经PI3K抑制剂预处理后，CCR7介导的Akt蛋白磷酸化及抗凋亡作用被阻断。结论在CCL21作用下，CCR7介导了抗凋亡效应，其对DCs的凋亡调控通过PI3K/Akt信号通路发挥作用。     

趋化因子CCL5促进乳腺癌细胞转移机制初探

目的:探讨趋化因子CCL5在人乳腺癌细胞MCF-7转移中的作用及其机制。方法:RT-PCR法测定MCF-7细胞中趋化因子CCL5的受体CCR5的表达;趋化小室检测不同浓度CCL5的作用下MCF-7细胞的侵袭活性;Western blot检测MCF-7细胞中Ezrin蛋白表达随CCL5趋化时间的变化。结果:人乳腺癌细胞MCF-7表达CCR5 mRNA,不同浓度(0.1-100μg/L)CCL5促进MCF-7细胞侵袭能力不同,Ezrin蛋白表达随CCL5促进乳腺癌细胞侵袭时间的延长明显增加。结论:趋化因子CCL5促进人乳腺癌细胞的趋化与侵袭,Ezrin蛋白在此过程中可能起着重要作用。     

Oncol2012: 腹腔镜下CO2气腹对结直肠癌细胞表达趋化因子受体CXCR4及CCR7的影响

目的 探讨不同压强、不同作用时间下持续性CO2气腹对结直肠癌细胞表达趋化因子受体的影响。 方法 建立体外气腹模型,选用人结直肠癌细胞株SW480,分别在6、9、12、15mmHg四种不同压强CO2气体下作用1h、2h及4h后,放在与无气腹组(37℃、5%CO2常规培养)相同的环境中分别培养0、24、48、72h后,使用免疫细胞化学法及RT-PCR检测趋化因子受体CXCR4、CCR7的表达。 结果 免疫细胞化学法检测结果显示SW480在相同作用时间下,经6、9、12、15mmHg压强的持续CO2气腹处理后,CXCR4表达下降;经12、15mmHg压强的持续CO2气腹处理后,CCR7表达下降,与无气腹组表达水平的差异均有统计学意义(P＜0.05),上述趋化因子受体表达在气腹处理后常规培养24、48h均增至无气腹组水平(P＞0.05)。CXCR4及CCR7的表达在相同作用时间下,随着压强增高,其表达量逐渐降低;在相同压强下,随着作用时间延长,其表达量无明显差异。 RT-PCR结果显示SW480在相同作用时间下经6、9、12、15mmHg压强的持续CO2气腹处理后,CXCR4 mRNA、CCR7 mRNA表达下降,与无气腹组表达水平的差异均有统计学意义(P＜0.05),上述趋化因子受体的mRNA表达在气腹处理后常规培养48h均增至无气腹组水平(P＞0.05)。CXCR4及CCR7的mRNA表达在相同作用时间下,随着压强增高,其表达量无明显差异;在相同压强下,随着作用时间延长,其表达量也无明显差异。 结论 不同压强CO2气腹能对结直肠癌细胞表面的趋化因子受体表达产生一过性影响,随CO2气腹压强的增高,可抑制趋化因子受体的表达。不同作用时间CO2气腹对结直肠癌细胞表面趋化因子受体的表达无明显影响。     

不同浓度次级淋巴组织趋化因子对溃疡性结肠炎大鼠淋巴细胞迁移的影响及其意义

目的 探讨不同浓度次级淋巴组织趋化因子(SLC)对溃疡性结肠炎(UC)大鼠淋巴细胞迁移能力的影响及意义.方法 60只大鼠分为UC模型组(模型组)、SLC抗体干预组(干预组)、对照组,各20只,采集各组大鼠门静脉血,分离出淋巴细胞培养,RT-PCR检测淋巴细胞趋化因子受体CCR7的表达,利用Boyden小室法探讨不同浓度SLC对不同组别淋巴细胞的体外趋化作用,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测淋巴细胞培养上清液中白细胞介素(IL)-10和干扰素(IFN)-γ的表达.结果 3组大鼠淋巴细胞均能表达趋化因子受体CCR7,模型组和干预组CCR7 mRNA的表达量(0.792±0.108、0.386±0.115)均明显高于对照组(0.106±0.029,均P<0.01);SLC对模型组的淋巴细胞有明显的趋化活性,并呈现剂最效应关系,80 ng/ml为SLC的饱和浓度,此浓度下可提高淋巴细胞的迁移能力,模型组与对照组相比,差异有统计学意义(迁移细胞数85.9±16.0 vs 20.5±1.8,P<0.01);干预组迁移细胞数(38.2±6.3)也高于对照组(P<0.05);淋巴细胞分泌IL-10的水平明显低于对照组(60±16 vs 195±39,P=0.036),IFN-γ的分泌明显高于对照组(150±26 vs 51±13,P=0.042).结论 SLC促进淋巴细胞的迁移,增强SLC诱导淋巴细胞细胞分化,参与UC的发病.     

脂蛋白和C反应蛋白对单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的 探讨单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及其受体趋化因子受体2(CCR-2)经动脉粥样硬化相关因素刺激后表达量的变化情况.方法 密度梯度离心法从健康成人外周血中分离获得单个核细胞,体外培养48 h.给予氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、C反应蛋白(CRP)及高密度脂蛋白(HDL)进行干预.干预后用实时荧光定量RT-PCR技术检测单核细胞MCP-1 mRNA和CCR2 mRNA的含量,ELISA法检测MCP-1蛋白含量.结果 ox-LDL+CRP组、ox-LDL、CRP处理组MCP-1和CCR2 mRNA表达水平和MCP-1蛋白含量明显高于对照组(P<0.05).而经HDL处理的单核细胞表达MCP-1和CCR2 mRNA水平下调,MCP-1蛋白含量低于对照组(P<0.05).结论 在体外培养的条件下.CRP和ox-LDL可以促进MCP-1和CCR2 mRNA表达,继而导致MCP-1含量增加,增强炎症反应的范围和强度.HDL可以有效的抑制MCP-1的表达.     

趋化因子MCP-1体外趋化骨髓基质细胞迁移的实验研究

目的探讨趋化因子MCP-1对骨髓基质细胞的体外迁移作用.方法采用全骨髓法培养成年Wistar大鼠骨髓基质细胞,取第5代骨髓基质细胞行免疫荧光鉴定;后通过细胞免疫荧光及RT-PCR的方法检测骨髓基质细胞表达趋化因子受体CCR2的情况,利用Boyden小室法探讨趋化因子MCP-1对骨髓基质细胞的体外趋化作用及其特异性.结果第5代骨髓基质细胞都表达间充质干细胞标记物Vimentin、Laminin及Fibronectin;细胞免疫荧光及RT-PCR结果证实骨髓基质细胞表达趋化因子受体CCR2,趋化因子MCP-1（5～500ng/mL）体外可趋化骨髓基质细胞迁移,抗MCP-1多克隆抗体可对抗其趋化迁移作用.结论MCP-1/CCR2通路参与骨髓基质细胞体外迁移,为进一步研究骨髓基质细胞的迁移机制提供了理论依据.     

反义肽核酸对树突状细胞CD86表达的抑制作用

目的 探讨CD86mRNA反义肽核酸（peptide nucleic acid,PNA)阻断树突状细胞CD86表达和第二信号传递的可能作用。方法 采用激光共聚焦显微镜研究生物素化PNA的细胞内化；利用流式细胞术，荧光细胞组织化学以及RT-PCR研究CD86反义PNA对CD86分子表达的抑制作用，结果 （1）激光共聚焦显微镜光学细胞切片证明，培养的人未成熟树突状细胞能够有效内化生物素化PNA。（2）流式细胞术和荧光细胞组织化学证实CD86反义PNA在蛋白质水平上对CD86分子表达有抑制作用。（3）RT-PCR证明反义PNA能够抑制DCCD86mRNA水平。结论 CD86反义PNA能够抑制人树突状细胞CD86mRNA的表达，从而为进一步利用反义PNA阻断第二信号传递，诱导免疫耐受奠定了基础。     

Inhibitory effect of 2′-o-methoxyethyl-modified antisense oligonucleotides targeting vascular endothelial growth factor A on SKOV3 human ovarian cancer cells

Background  Ovarian cancers are often at an advanced stage at diagnosis because early detection is difficult. The poor prognosis of ovarian cancers highlights the crucial need to develop better therapeutic agents and strategies. The objective of this study was to investigate the inhibitory effects of a new modified antisense oligonucleotides targeting vascular endothelial growth factor A (VEGF-A) in SKOV3 ovarian cancer cells.

Methods  Antisense oligonucleotides targeting VEGF-A was designed, synthesized and transfected into SKOV3 ovarian cancer cells. Western blotting and real-time RT-PCR were used to analyze the inhibitory effects of antisense oligonucleotides on VEGF-A protein and mRNA expression. Transwell matrix assay was used to detect cell migration inhibition.

Results  The antisense oligonucleotides targeting VEGF-A significantly decreased VEGF-A protein and mRNA expression and inhibited cell migration in SKOV3 ovarian cancer cells.

Conclusions  This new modified antisense oligonucleotides targeting VEGF-A can decrease VEGF-A expression and inhibit cell migration in SKOV3 ovarian cancer cells. This new oligonucleotides may be a promising therapeutic agent for ovarian cancers.

     

腺病毒介导反义RNA抑制HIV-1辅助受体CCR5和CXCR4表达

目的抑制细胞表面人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的辅助受体CCR5和CXCR4表达,阻止HIV-1进入靶细胞。方法逆转录聚合酶链反应扩增HIV-1辅助受体基因5'-端cDNA片段,反向插入穿梭质粒中,再与腺病毒基因组骨架质粒在大肠杆菌BJ5183中同源重组,重组质粒在293细胞中包装、扩增得到含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒,分别感染U937细胞和MT4细胞,于感染后24、48和72h及10d时用流式细胞仪检测细胞表面相应受体的表达。并用Boyden小室法检测重组腺病毒感染对细胞趋化活性的影响以及用3H掺入法检测对细胞增殖能力的影响。结果成功获得含有CCR5和CXCR4反义RNA的重组腺病毒,其滴度为5×1011PFU/ml和7×1010PFU/ml。重组腺病毒感染24h后流式细胞仪检测显示,U937细胞表面CCR5的表达率分别为:Ad-antiR51.12%,未感染细胞对照82.10%,Ad-senseR580.94%,Ad-control81%。MT4细胞表面CXCR4的表达率分别为:Ad-antiX41.03%,未感染细胞对照42%,Ad-senseX444%,Ad-control39%。48、72h及10d后Ad-antiR5感染的U937细胞表面CCR5表达率分别为:1.02%、1.26%、1.23%;Ad-antiX4感染的MT4细胞表面CXCR4表达率分别为:1.13%、1.17%、1.22%。感染重组腺病毒后,两种细胞的趋化活性及增殖能力均无改变。结论包含有CCR5、CXCR4反义RNA的重组腺病毒可以使细胞表面相应受体表达下降,且重组腺病毒不影响细胞的趋化活性和增殖能力。     

红树林淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠DCs吞噬功能的影响

目的 探讨红树林来源的淡紫拟青霉胞外多糖对小鼠骨髓源性树突细胞(DCs)功能成熟的影响.方法 从小鼠骨髓腔中分离获得骨髓细胞,加入重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)诱导分化为未成熟DCs,用不同浓度淡紫拟青霉胞外多糖干预,流式细胞术检测DCs的表面标志CD11c、主要组合相容性复合体(MHCⅡ)类分子、CD80、CD86的表达情况及吞噬葡聚糖(FITC-dextran)的能力,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测该多糖对DCs Toll样受体(TLR)2 mRNA和TLR4 mRNA表达的影响.结果 经300、400 μg/mL多糖作用48 h后DCs表面分子CD11c、MHCⅡ类分子、CD80、CD86的表达较空白对照组显著上调(P＜0.01);经多糖作用的DCs吞噬FITC-dextran能力下降,尤其是300、400μg/mL的多糖与空白对照组相比作用效果明显(P＜0.05);另外,该多糖还可下调DCs TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,尤其经100～400μg/mL多糖处理的DCs下调作用显著,与空白对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 淡紫拟青霉胞外多糖可上调小鼠骨髓源性未成熟DCs表面CD11c、MHCⅡ类分子、CD80和CD86的表达,降低其吞噬能力,下调TLR2 mRNA和TLR4 mRNA的表达,初步表明该多糖可刺激DCs分化成熟.     

Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响

目的：探讨Survivin反义核酸对乳腺癌细胞增殖的影响。方法：本实验分6组，分别以脂质体介导反义寡核苷酸、无义寡核苷酸及RPMI 1640培养液作为空白的对照组，转染人乳腺癌MCF-7细胞系，采用Realtime RT-PCR，Western blot方法检测各组MCF-7细胞Survivin蛋白及mRNA的表达情况，测定转染后细胞贴壁率变化，研究Survivin反义寡核苷酸对MCF-7细胞的生长抑制作用。结果：脂质体介导Survivin反义寡核苷酸转染人乳腺癌MCF-7细胞后，细胞内Survivin蛋白及mRNA表达显著降低，通过Realtime RT-PCR检测MCF-7细胞经作用后其Survivin mRNA起始拷贝数明显下降；同时细胞贴壁率降低达32．96％，细胞生长抑制率最高达73．62％，ASOND／LiP组与NODN／LiP组和LiP组差异有显著性（P＜0．05）。结论：脂质体介导转染的反义寡核苷酸可在Survivin蛋白及mRNA水平有效地降低乳腺癌MCF-7细胞内Survivin的表达，并能够有效抑制乳腺癌细胞的增殖活性，提示Survivin靶向治疗可能成为乳腺癌综合治疗的一种重要方法。     

MicroRNA-25表达下调对神经胶质瘤U87细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨microRNA-25（miR-25）表达下调对神经胶质瘤U87 细胞增殖与凋亡的影响,以及miR-25 与B 细胞淋巴瘤/ 白血病-2 基因（Bcl-2）在胶质瘤细胞增殖与凋亡过程中的调节作用。方法通过慢病毒介导反义miR-25 寡聚核苷酸转染U87 细胞;分为3 组,实验组（转染anti-miR-25）、对照组（转染negative control）和空白组（空白PBS）;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测miR-25 和Bcl-2 的mRNA 表达水平;CCK-8 法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡。结果实验组miR-25 和Bcl-2 的mRNA 表达量与空白组和对照组比较,差异具有统计学意义（P <0.05）,实验组降低;实验组相对于空白组和对照组,细胞增殖活性降低,细胞周期延缓,细胞凋亡率升高。结论在胶质瘤U87 细胞,miR-25 表达下调通过作用于Bcl-2 靶基因,延缓细胞周期,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

反义凝血酶受体ODNs对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 :为研究凝血酶受体在血管平滑肌细胞增殖中的作用 ,探讨反义凝血酶受体ODNs对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响 .方法 :通过培养SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞 ,以3 H -TdR掺入率作为评价反义凝血酶受体ODNs抑制血管平滑肌细胞增殖的指标 ,用反转录聚合酶链反应检测反义凝血酶受体ODNs 抑制血管平滑肌细胞凝血酶受体mRNA的表达 ,用Western -Blot检测反义凝血酶受体ODNs抑制血管平滑肌细胞凝血酶受体蛋白质的表达 .结果 :反义凝血酶受体ODNs明显抑制血管平滑肌细胞的增殖 (与对照组相比 ,P <0 0 5 ) ,明显抑制血管平滑肌细胞的凝血酶受体mRNA和蛋白的表达 .结论 :反义凝血酶受体ODNs明显抑制血管平滑肌细胞的增殖 ,其抑制血管平滑肌细胞的增殖是通过抑制凝血酶受体基因的表达 ,特别是通过抑制DNA、mRNA和蛋白的表达来完成 .     

过敏性哮喘患者树突状细胞的趋化因子受体及表型研究

目的:探讨过敏性哮喘患者和健康人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)负荷抗原后表达组成性趋化因子受体(CCR7)和MHCⅡ类分子(HLA-DR)的差异,为进一步研究过敏性哮喘的发病机制及治疗提供新的思路。方法:分别从过敏性哮喘患者(哮喘组)和健康人(对照组)外周血分离单个核细胞并获取贴壁细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重组人白细胞介素-4(rhIL-4)体外培养为未成熟DC,加入Der p 1使其负荷抗原;观察培养的DC的形态变化,并用流式细胞仪检测两组负荷抗原的DC表面趋化因子受体(CCR7)及MHCⅡ类分子(HLA-DR)的表达。结果:与对照组相比,哮喘组负荷抗原的DC表达较高水平CCR7(P<0.01)及HLA-DR(P<0.01);两组CCR7和HLA-DR均呈正相关(哮喘组r=0.73,P<0.05;对照组r=0.76,P<0.05)。结论:由于过敏性哮喘患者负荷抗原的DC与健康人相比在趋化因子受体及成熟标志物表达方面存在明显差异,从而趋化因子反应性及成熟情况存在差异,后者成为哮喘发生的重要机制之一。