VEGF165真核表达载体的构建及其在鼠膀胱平滑肌细胞的表达

目的 构建血管内皮生长因子(VEGF165)真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165,转染鼠膀胱平滑肌细胞并检验其生物学活性.方法 将VEGF165 cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(-),构建真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165;并转染入鼠膀胱平滑肌细胞,采用RT-PCR和免疫荧光染色检测VEGF165基因在鼠膀胱平滑肌细胞中的表达,并用MTT法检测转染后细胞上清液中VEGF165的生物学活性.结果 和结论将构建的真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF165转染入鼠膀胱平滑肌细胞后,VEGF的表达增高,转染后细胞上清液具有促使内皮细胞增殖的生物学活性.     

人VEGF165基因转染兔骨髓内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的 探讨人血管内皮生长因子165(hVEGF165)基因转染兔骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响.方法 体外分离、培养、扩增并鉴定EPCs,脂质体介导转染携带增强型绿色荧光蛋白标记的VEGF165质粒、空白质粒,同时经ELISA法检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,并采用CCK-8法检测对其增殖的影响.结果 FITC标记荆豆凝集素Ⅰ和Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白荧光双染证实正在分化的EPCs,同时经免疫组化法证实VEGF受体2 FLk-1和Ⅷ因子的表达;VEGF165质粒转染组EPCs上清液中表达VEGF165,VEGF165转染EPCs的转染率约22.5%;hVEGF165基因转染促进EPCs增殖.结论 hVEGF165基因可成功转染EPCs,且可促进EPCs的增殖,为基因治疗血管性疾病提供了动物实验基础.     

人VEGF 165基因转染大鼠内皮祖细胞及对其增殖的影响

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对EPCs增殖的影响。方法体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组。ELISA检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响。结果FITC-UEA-Ⅰ和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖。结论EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且可促进EPCs的增殖,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

正、反义VEGF基因转染对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖行为的影响

目的探讨正、反义血管内皮生长因子(VEGF)基因对人增生性瘢痕成纤维细胞(HHSFb)增殖行为的影响。方法采用组织块法获取HHSFb,行细胞免疫化学鉴定。构建靶向VEGF基因pcDNA3.1(+)/hVEGF165(正义组)、pcDNA3.1(-)/hVEGF165(反义组)和空质粒pcDNA3.1(+)(空载体组)转染人成纤维细胞,以及未行转染处理的人成纤维细胞(对照组),共设为4组。经G418筛选获得阳性转染细胞克隆。逆转录-多聚酶链式反应(RT-PCR)显示VEGF基因在细胞内的表达,上清行酶联免疫吸附反应(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平,MTT测定细胞体外生长情况。结果成功构建正、反义VEGF基因表达载体。经统计学分析,与对照组和空载体相比,正义组VEGF mRNA表达增强,蛋白表达增强;反义组VEGF mRNA表达明显减弱,蛋白表达明显降低。MTT结果显示,转染前后细胞体外生长速度基本一致。结论正义VEGF基因重组质粒对HHSFb内源性VEGF的表达有促进作用,反义VEGF基因重组质粒可有效抑制HHSFb内源性VEGF的表达。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

骨髓间充质干细胞的肌源性诱导分化及转染VEGF基因的表达

目的 体外诱导兔骨髓间充质干细胞向肌源性细胞分化,并观察血管内皮生长因子AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒转染骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)后的表达。方法 将20只兔随机分为对照组和实验组,从骨髓液中分离MSCs,对照组以低糖DMEM培养,实验组加用5-氮胞苷(10 mmol/L)诱导培养,第28天进行肌钙蛋白I免疫组化染色。另构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒,通过脂质体转染对照组MSCs,用Northern blotting和Western blotting鉴定血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并用ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度。结果 成功分离培养出兔MSCs,实验组经5-氮胞苷诱导后MSCs向肌源性细胞分化,肌钙蛋白I免疫组化染色阳性。成功构建AdTrackCMV-hVEGF165真核表达质粒并通过脂质体转染MSCs,Northern blotting示转染的MSCs VEGF165表达信号明显强于未转染细胞,Western blotting 示转染VEGF165基因的MSC表达VEGF,ELISA法测定培养上清液中VEGF的浓度在转染后第3天(1 011 pg/ml)和第5天(1 027 pg/ml)达高峰,此后逐渐下降,但至第13天(349 pg/ml)仍显著高于空白对照(116 pg/ml)和pAdTrackCMV组(125 pg/ml),P<0.01。结论 兔骨髓间充质干细胞可在体外向肌源性细胞分化,转染VEGF基因可表达VEGF,有望将干细胞移植和基因治疗结合以治疗缺血性心脏病。     

VEGF165和VEGF165b真核表达质粒的构建和鉴定

目的:构建人血管内皮生长因子(VEGF)165和VEGF165b真核表达质粒,为VEGF165和VEGF165b功能研究奠定基础.方法:应用RT-PCR方法从人肺腺癌A549细胞中获得并扩增VEGF165 cDNA,双酶切后与真核表达载体pcDNA3.0连接,构建重组质粒pcDNA3.0-VEGF165,酶切、PCR及...     

血管内皮生长因子基因修饰内皮祖细胞对内膜损伤血管修复的影响

目的 探讨人血管内皮细胞生长因子165(hVEGF165)基因转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)及对EPCs增殖的影响,在体研究VEGF基因修饰EPCs对内膜损伤血管再内皮化的影响.方法 体外分离、培养、鉴定EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组、pcDNA3空质粒转染组、空白对照组.ELISA法检测EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测hVEGF165基因修饰对EPCs增殖的影响.基因修饰EPCs移植到内膜损伤血管模型中,观察基因修饰对EPCs修复内膜损伤的效应.结果 FITC-UEA-Ⅰ和DiⅠ-acLDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs迁移、黏附和增殖.基因修饰EPCs促进损伤内膜修复.结论 EPCs可以成功转染hVEGF165基因,并且促进EPCs的迁移、黏附和增殖,增强EPCs对损伤内膜修复的能力.     

VEGF165基因转染EPCs移植对大鼠阿霉素肾病组织学的影响

目的 构建含血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒(Ad-VEGF165),转染血管内皮祖细胞(EPCs)后,观察其对阿霉素肾病大鼠肾脏组织学的影响.方法 用细菌内同源重组法构建含VEGF165基因的重组腺病毒Ad-VEGF165,通过PCR和Western blot鉴定所构建的腺病毒.贴壁法体外培养获得大鼠骨髓来源的EPCs,Ad-VEGF165体外转染EPCs,检测转染后目的基因的蛋白表达.大鼠阿霉素肾病模型形成过程中,尾静脉注射转染Ad-VEGF165的EPCs,在第16周时观察肾脏组织学变化.结果 PCR和Western blot证实构建的重组腺病毒含有目的基因,滴度为1.4×1010PFU/ml;培养第6天的EPCs用于Ad-VEGF165转染,转染后24 h,培养上清中VEGF蛋白表达较对照组和转染前增加.转染了VEGF165基因的EPCs移植后第12周(切肾术后16周),转染组的肾小球硬化和肾小管间质纤维化的程度明显较肾病组轻.结论 转染了VEGF165基因的EPCs可以减轻阿霉素肾病的肾小球和肾小管的损伤程度,为VEGF在慢性肾脏病治疗提供了实验基础.     

VEGF基因转染结合脱蛋白骨修复股骨头坏死的实验研究

目的:构建pcDNA3.1/VEGF165质粒及联合脱蛋白骨基因治疗早期股骨头缺血性坏死.方法:将含人VEGF165全长cDNA序列的克隆载体pUC18/VEGF165与pcDNA3.1( )载体构建成重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165;69只AVNFH造模成功后的新西兰大白兔随机分成3组.第一组,将脱蛋白骨复合pcDNA3.1/VEGF165质粒植入坏死的股骨头内;第二组植入DPB;第三组仅在股骨头内钻一隧道.股骨头标本术后3天,1,2,4,8和16周获取.RT-PCR检测VEGF165mRNA的表达,Western blot检测VEGF165蛋白的表达,组织形态学分析血管发生和股骨头修复.结果:成功构建pcDNA3.1/VEGF165;第一组VEGF165 mRNA和蛋白表达术后1周达到高峰,时间持续超过3周.血管形成术后2,4周增加,骨形成术后2,4和8周增加,与另两组相比差异呈显著性(P＜0.01).结论:VEGF165基因转染可促进局部血管的早期形成,DPB-VEGF复合物可增加骨形成.脱蛋白骨联合VEGF165基因治疗为骨坏死的修复提供了理论基础.     

Transplantation of VEGF165-gene-transfected endothelial progenitor cells

Background: To study the cotherapeutic effect of stem cell transplantation and gene transfection on chronic venous thrombosis. Methods: We constructed a recombinant adenoviral vector carrying the VEGF165 gene by using the pAdEasy system, which was subsequently identified and amplified. Simultaneously, endothelial progenitor cells (EPCs) were isolated from rat bone marrow by using Ficoll, cultured in EBM-2MV medium, and identified. Then, the cells were transfected with the recombinant Ad-VEGF165. The EPCs were labeled with 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (Dil) before transplantation. An experimental rat model of chronic vein thrombosis was developed by partial ligation of the inferior vena cava. The rats were randomly divided into 4 groups: A (n = 25), Ad-VEGF165/EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of Ad-VEGF165/EPCs; B (n = 25), EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of EPCs; C (n = 25), Ad/EPC-transplantation group, which received 1 ml (106) of Ad/EPCs; D (n = 25), control group, which received 1 ml of the transplantation medium. The thrombi and adjacent caval walls were harvested 28 days after transplantation; real-time quantitative polymerase chain reaction (PCR) was used to detect the expression level of VEGF mRNA; and western blotting was used to measure thrombosis and changes in VEGF protein expression. Hematoxylin-eosin (HE) staining and immunohistochemical staining were performed to detect recanalization, and neovascularization was observed by scanning electron microscopy. The capillary density was quantitatively determined by counting the capillaries under a high-power microscope. SPSS 11.5 software used for analysis, and differences at P < 0.05 were considered to be significant. Results: The Ad-VEGF165 was constructed, and bone-marrow-derived EPCs were cultivated and successfully identified. We determined the optimum transfection ratio that promoted the growth of EPCs. After transfection, the EPCs secreted the VEGF protein. After transplantation, the in vivo survival of EPCs and their differentiation into endothelial cells were determined by detecting the fluorescence associated with the Dil stain. VEGF mRNA was expressed in groups A, B, C, and D after transplantation, and the VEGF mRNA level in group A was significantly higher than those in groups B, C, and D (P < 0.05); the VEGF mRNA levels in groups B and C were significantly higher than those in group D (P < 0.05), and there was no statistical significance between the VEGF mRNA levels in groups B and group C. The recanalization capillary density in group A was significantly higher than those in groups B, C (P < 0.05), and D (P < 0.01); the recanalization capillary densities in groups B and C were significantly higher than that in group D (P < 0.05). Moreover, there was no statistical significant difference between the values for groups B and C. Neovascularization was detected by immunohistochemical staining using the antibody for vWF, which is a component of endothelial cells. Conclusion: The EPCs were successfully transfected by Ad-VEGF165. A suitable transfection ratio can improve the efficiency of EPCs, improving the possibility of promotion of angiogenesis after transplantation. Transfected EPCs caused accelerated organization and recanalization of vein thrombi.     

人血管内皮生长因子165的基因克隆

目的 :克隆人血管内皮生长因子 1 6 5( h VEGF16 5)的 c DNA序列 ,进而进行序列分析。方法 :异硫氰酸胍一步法从人胎盘组织中提取总 RNA,利用逆转录 -聚合酶链反应( RT-PCR)的方法扩增出 h VEGF16 5c DNA,与 p GEM-T easy连接形成 p GEM/h VEGF16 5重组质粒 ,双脱氧链终止法测定核苷酸序列。结果 :通过 DNA SIS软件将测序结果与已发表的h VEGF16 5序列 ( NM0 0 3 3 76 )比较 ,核苷酸序列完全一致。结论 :获得了 h VEGF16 5的 c DNA基因 ,为下一步的研究工作奠定了基础     

血管内皮生长因子165核酶的合成及其体外活性

目的 探讨抗血管内皮生长因子165（VEGF165）核酶的设计合成及其生物学活性。方法 利用计算机辅助设计针对VEGF165的锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体pGEMRz212，体外转录合成核酶Rz212及其相应的底物VEGF165mRNA，在无细胞体系中观察核酶对靶RNA的切割作用。结果 构建的自剪切转录载体在转录的过程中发生了自身剪切，并释放出目的核酶Rz212，该核酶具有切割VEGF165 mRNA的作用。结论 计算机辅助设计的VEGF165锤头状核酶体外可有效切割靶RNA，具有较高的生物活性。     

人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体的构建及其在大肠杆菌的表达

目的　获得人血管内皮生长因子 (hVEGF165)cDNA ,构建真核表达载体 ,并研究其在大肠杆菌中的表达情况。方法　采用PCR方法 ,从HL6 0细胞中扩增出hVEGF165cDNA ,将其克隆至 pcDNA3 真核表达载体上 ,构建成为 pCD hVEGF165重组质粒。将重组质粒转染感受态的大肠杆菌BL2 1(DE3)中进行表达 ,用Westernblot检测表达产物。结果　经酶切鉴定及基因测序证实hVEGF165cDNA基因克隆成功 ,并建立了高效表达的 pCD hVEGF165重组质粒。Westernblot检测表明 ,组建了具有高效表达hVEGF165的大肠杆菌菌株。结论　成功地克隆和表达出了hVEGF165基因 ,为进一步建立VEGF转基因动物模型 ,研究其在视网膜新生血管性疾病中的应用奠定了基础     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础     

经心包腔转染腺病毒血管内皮生长因子165基因对猪冠脉血管形成的影响

目的:探讨以腺病毒为载体的血管内皮生长因子165(Ad-VEGF165)基因经心包腔转染的表达规律、合适的剂量及对缺血心肌血管生成的作用.方法:随机将20头中华小型猪分为实验组和对照组,每组10头.采用球囊堵塞前降支第一对角支远端建立心肌梗死模型.构建后即刻,实验组采用经皮剑突下穿刺,中心静脉导管插入心包腔内,以含胶原酶1 200 u及透明质酸酶3 000 u的生理盐水2 ml预处理心包后,在心包腔内注入含Ad-VEGF165基因2.0×109pfu的生理盐水1 ml;对照组同样方法预处理心包后,在心包腔内注射生理盐水1 ml.注射后3 d(n=2)、7 d(n=2)及28 d(n=6)分别用免疫组化、超声心动图检测缺血心肌血管新生情况及心功能,并以酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测血浆及心肌组织中Ad-VEGF165的表达.结果:Ad-VEGF165基因经心包腔转染缺血心肌组织后,在心肌组织中呈高表达,于7 d达到高峰,28 d降至基线水平,血浆中无目的基因的表达;28 d时,实验组缺血心肌微血管密度(MVD)、心功能均明显高于对照组(MVD(517.00±75.70)mm-2vs(226.50±54.10)mm-2,P=0.009;LVEF(%)(72.11±5.20)w(55.14±4.37),P=0.005).结论:用胶原酶及透明质酸酶预处理心包后,经其转染Ad-VEGF165可以诱导急性心肌梗死模型局部VEGF蛋白表达,促进缺血心肌组织血管新生并能改善心功能.