正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体构建及鉴定

目的构建肝癌相关新基因BC047440反义真核表达载体.方法提取人肝癌组织总RNA,逆转录酶-多聚酶链式反应(RT-PCR)扩增BC047440基因cDNA序列,经与pMD18-T simple载体连接,筛选、克隆、抽提质粒和双酶切后,将纯化的BC047440基因cDNA序列反向插入真核表达载体pcDNA3.1( )中,筛选、克隆、抽提质粒,从而构建BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS.结果经RT-PCR获得826 bp含限制性内切酶位点的cDNA片段,T载体克隆后经PCR扩增目的片段、测序,确定该片段为BC047440基因cDNA,进而构建反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,并经PCR扩增目的片段,测序确证.结论成功构建了BC047440基因反义真核表达载体pcDNA3.1( )BC047440AS,为进一步研究该基因功能奠定了基础.通过抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridization,SSH)对肝癌组织与癌旁肝组织间差异表达基因进行分离、鉴定,我们发现了1条新的肝癌相关基因cDNA片断(EST)[1],长447 bp,经GenBank检索,90%与已知基因无同源性.进一步采用RACE技术,克隆出该基因的全长cDNA序列[2].经GenBank检索,与近期登录的基因BC047440同源.但该基因是从大脑组织中获得[3],而且国内外少见该基因功能研究的报道.在此基础上,本研究从原发性肝癌组织中克隆了BC047440基因的全长cDNA序列,并构建了其反义RNA真核表达载体,为进一步研究该基因功能奠定基础.     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的构建人PCK1基因的真核表达载体。方法以人内脏脂肪细胞cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致。重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1( )中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人PCK1基因克隆及其表达载体的构建

目的 构建人PCK1基因的真核表达载体.方法 以人内脏脂肪细胞cDNA为模板, 聚合酶链反应(PCR)扩增PCK1基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)中,并进行双酶切鉴定.结果 PCR扩增的特异性片段长度为1 972 bp,以此构建的pGEM-T-PCK1克隆载体,经限制性内切酶酶切证实载体中带有PCK1基因的目的片段,与GenBank中的人PCK1基因cDNA序列一致.重组质粒pcDNA3.1-PCK1经KpnⅠ/XbaⅠ双酶切后显示5.1 kb和 2 000 bp左右的2个条带,证明PCK1基因已成功克隆到了真核细胞表达载体pcDNA3.1(+) 中.结论 成功构建了野生型pcDNA3.1-PCK1重组真核表达载体.     

RPL23编码基因的克隆及其正反义核酸转染胃癌细胞

目的 扩增人核糖体蛋白L23（RPL23）编码基因序列，构建其正、反义真核表达载体，分别转染胃癌细胞SGC7901及胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR，以进一步研究RPL23基因与胃癌多药耐药的关系。方法 按文献报道的RPL23核苷酸序列设计合成PCR引物，利用总RNA抽取试剂盒从人胃癌长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，再用PCR方法扩增目的基因序列。PCR产物经DNA序列测定证实后，通过双酶切，将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )K ，酶切电泳鉴定。采用脂质体介导的方法将pcDNA3.1( )-RPL23转染SGC7901细胞，pcDNA3.1（＋）－anRPL23转染SGC7901／VCR细胞，经G418筛选后，随机挑选细胞克隆。通过斑点杂交检测正、反义转染后RPL23 mRNA表达水平的变化。结果 应用RT－PCR反应扩增获得大小约0.5kb的特异性片段。经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPL23编码区序列一致。重组正义真核表达载体pcDNA3.1( )-RPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段；重组反义真核表达载体pcDNA3.1( )-anRPL23双酶切产生大小约5.4kb,0.5kb的片段，均与预期结果相符。转染细胞经筛选后，随机挑选，扩增了2个细胞克隆，斑点杂交提示反义转染后RPL23mRNA表达水平显著下降，而正义转染后其表达水平明显增加。结论 成功克隆了人RPL23编码基因序列，并构建了其正、反义真核表达载体。在胃癌细胞系SGC7901及长春新碱耐药细胞SGC7901／VCR中得到稳定转染细胞株，正义转染细胞中RPL23mRNA表达明显增加，反义转染细胞中表达明显受抑。     

小鼠cyclin A2正义和反义真核表达载体的构建及鉴定

目的构建小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。方法采用小鼠胚胎组织取材,提取总RNA。设计引物,采用RT-PCR方法扩增小鼠cyclin A2 mRNA得到cyclin A2的DNA,将此DNA插入pGEM-T载体,转化入JM109感受态细菌。将鉴定得到的重组质粒进行扩增,EcoRⅠ酶切后,回收cyclin A2目的片段亚克隆入pcDNA3.1真核表达载体。酶切筛选鉴定重组的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2。结果将小鼠基因的开放阅读框(ORF)重组到真核表达载体pcDNA3.1内,用EcoRⅠ酶切重组质粒后可得到一接近1660 bp的DNA条带,核酸测序证实和GenBank所公布序列相符。HindⅢ酶切鉴定重组质粒后,证明分别为正向和反向插入载体的质粒。DNA测序证明构建的真核表达载体pcDNA3.1-cyclin A2的序列是正确的。结论成功构建了小鼠cyclin A2的正义和反义真核表达载体。     

真核表达质粒pcDNA3.1-asHpa的构建及意义

目的 :构建乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,探索恶性肿瘤基因治疗的新途径。方法 :以质粒pcDNA3.1为载体 ,将乙酰肝素酶信号密码的DNA片段反向插入其多克隆位点得到反义乙酰肝素酶信号密码真核表达载体 (pcDNA3.1-asHpa)。 结果 :经过PCR扩增鉴定、电泳证实获得的重组基因插入方向和插入序列大小正确。结论 :成功的构建了乙酰肝素酶信号密码的反义基因真核表达载体 ,可以进一步用于反义基因表达的实验研究     

人DNA聚合酶δ2真核载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的构建人DNA聚合酶δ2(DNA Polδ2)真核表达载体,转染人胚胎肾细胞(HEK293)并观察其表达水平。方法用逆转录PCR(RT-PCR)方法从人胚肺成纤维细胞(WI38细胞)扩增目的基因DNA Polδ2cDNA片段,与pMD-18T载体连接,构建质粒pMD-18T-Polδ2;将目的片段DNA Polδ2从质粒pMD-18T-Polδ2切下,与真核表达载体pcDNA 3.1(+)连接,构建正义及反义真核表达载体pcDNA 3.1-Polδ2。应用脂质体转染试剂,分别将正义、反义真表达载体pcDNA 3.1-Polδ2,空载体pcDNA3.1(+)转染至HEK293细胞,同时设置阴性对照;用RT-PCR和Western blot方法检测目的基因DNA Polδ2mRNA及蛋白表达水平。结果正义和反义DNA Polδ2真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2中插入的目的片段与GENEBANK上DNA Polδ2cDNA序列完全一致。RT-PCR方法显示正义及反义真核表达载体转染组细胞的目的基因DNA Polδ2mRNA表达均明显高于空载体转染组及阴性对照组;Western blot显示正义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达明显增强,反义真核表达载体转染组细胞DNA Polδ2蛋白表达阴性。结论人DNA Polδ2正义及反义真核表达载体pcDNA3.1-Polδ2构建成功。     

人癌胚抗原基因的克隆及基因疫苗的构建

目的:克隆人癌胚抗原(CEA)基因cDNA,构建CEA基因疫苗.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人结肠癌细胞组织克隆出细胞中CEA基因片段,通过基因重组技术将该基因片段重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建成pcDNA3.1/CEA疫苗,分别用PCR扩增、酶切电泳分析及DNA测序的方法对pcDNA3.1/CEA疫苗进行鉴定.结果:经PCR扩增发现2.1 kb的目的基因条带、酶切电泳分析可见2.1 kb的目的基因条带和5.4 kb的载体条带、DNA测序证实载体中的目的基因序列与CEA的cDNA序列完全相同.结论:本实验成功地克隆了CEA 基因并构建了其基因疫苗,为进一步研究CEA基因疫苗抗肿瘤的实验打下基础.     

人核糖体蛋白S13编码基因的克隆及其正反义真核表达载体的构建

目的：克隆人核糖体蛋白S13(RPS13)cDNA片编码区全长序列，构建其正、反义真核表达载体，以进一步研究RPS13基因与胃癌多药耐药的关系。方法：采用RT-PCR法扩增RPS13cDNA片段编码区全长序列，DNA重组技术构建其正、反义真核表达载体。结果：RT-PCR法成功扩增了RPS13cDNA片段编码区全长序列，经DNA序列分析，证实与文献报道的人RPS13编码区序列一致。目的基因分别按正、反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（ ），并经酶切鉴定证实。结论：成功克隆了人RPS13编码区全长基因序列，并构建了正、反义真核表达载体。     

人骨唾液酸蛋白正反义真核表达载体的构建及在骨肉瘤细胞中的表达

目的 构建人骨唾液酸蛋白（hBSP）正反义真核表达载体，并检测其在骨肉瘤细胞MG-63中的表达。方法 以人骨膜细胞总RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增出hBSP全长序列，通过DNA重组技术构建hBSP正反义核酸真核表达载体，并用脂质体介导转染人MG-63细胞，通过RT-PCR及Western blot检测细胞中hBSPmRNA和蛋白的表达。结果 成功构建了hBSP正反义核酸真核表达载体，转染后有效表达hBSP，正义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平升高，反义载体转染后使MG-63细胞中hBSPmRNA和蛋白表达水平降低。结论 转染正反义hBSP表达载体导致瘤细胞BSP表达的改变，为进一步实验研究提供了基础。     

正、反义Heparanase基因荧光真核表达载体的构建及胰腺癌SW1990细胞转染

目的构建正、反义人肝素酶绿色荧光蛋白真核共表达载体,并转染人胰腺癌SW 1990细胞.方法用EcoR I从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入pIRES2-EGFP质粒的EcoR I酶切位点上,经BamH I酶切鉴定出正义和反义表达载体,并进一步测序确认.用脂质体法将肝素酶正、反义真核表达载体转染人胰腺癌SW 1990细胞,24 h后荧光倒置显微镜下检测转染结果.结果经BamH I酶切后,正义质粒形成5.3 kb和1.7 kb两条DNA片段,反义重组质粒为6.5 kb和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值一致;测序结果进一步确认了方向的正确性.转染成功的胰腺癌细胞在倒置荧光显微镜下呈绿色荧光.结论成功构建了人肝素酶正、反义真核表达载体,并成功转染人胰腺癌细胞株SW 1990,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对胰腺癌细胞的转移能力的影响奠定基础.     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

Cloning and Expression of Rat Transforming Growth Factor β1 cDNA in Osteoblasts

In order to study transforming growth factor81 (TGF51) in molecular level and investigate thefeasibility of TGF51 gene therapy for bone defects,an eukaryotic expression vector containing ratTGF51 cDNA was constructed. The expression ofTGF51 in the transfected osteoblasts was observed.1 MATERIALS AND METHODS1. 1 Animals and Cell CultureSprague--Dawley rats, I adult and 5 newborn,were purchased from Animal Center of Tong nMedical University. Lymphocytes, isolated fromperipheral…     

人肝素酶基因正反义荧光真核表达载体的构建及肺癌细胞转染

目的: 构建正义和反义人肝素酶与绿色荧光蛋白真核共表达载体,并分别转染人低转移肺癌细胞株95C及高转移细胞株95D. 方法: 采用基因重组技术,用EcoRⅠ从pcDNA3-Hpa质粒上切下约1.7 kb的人肝素酶全长cDNA片段,然后连入 pIRES2-EGFP质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并用脂质体法将肝素酶正义真核表达载体转入人低转移肺癌细胞株95C、反义真核表达载体转入人高转移肺癌细胞株95D,G418筛选后,荧光倒置显微镜检测转染结果. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成5.3 1.7 kb两条DNA片段,而反义重组质粒为6.5和0.5 kb两条DNA片段,与理论计算值完全一致;转染后肺癌细胞倒置荧光显微下呈绿色荧光. 结论: 成功构建了人肝素酶的正、反义真核表达载体,并成功转染人低、高转移肺癌细胞株,为进一步研究正、反义肝素酶基因转染对肿瘤细胞的影响奠定了基础.     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.     

反义VEGF165真核表达载体的构建和表达

目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。     

人核糖体蛋白L6编码基因的克隆及正反义真核表达载体的构建

目的：通过克隆人核糖体蛋白L6（RPL6） cDNA序列，构建其正反义真核表达载体，以探讨RPL6与白血病多药耐药的关系。方法：用RT—PCR技术扩增RPL6 cDNA序列，DNA重组技术构建其正反义真核表达载体。结果：成功扩增RPL6 cDNA序列，经DNA测序，证实与GenBank中的人RPL6编码区序列一致，酶切证实目的基因分别按正反两个方向亚克隆至真核表达载体。结论：成功克隆人RPL6 cDNA序列，并构建了正反义真核表达载体。