c-myc基因核酶对靶mRNA的切割作用

目的：构建c—myc基因核酶及其靶mRNA的体外转录载体，探讨核酶对靶mRNA的体外切割作用。方法：通过计算机分析c—myc基因mRNA的二级结构，设计核酶基因序列，采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建入pGEM3Zf( )体外转录载体，将大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段克隆入pGEM7Zf(-)体外转录载体，分别进行体外转录获得核酶及靶mRNA。在含有Mg^2 的反应体系中，进行核酶对靶mRNA的体外切割反应。结果：经限制性内切酶酶切鉴定，核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，经DNA自动序列分析仪测序分析，大鼠c—myc基因第2外显子及部分第3外显子的基因片段准确克隆入pGEM7Zf(-)载体。核酶对靶mRNA的体外切割活性约为64．5％。结论：该核酶具有切割靶mRNA的活性，可进一步用于细胞内和体内研究。     

核酶对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

目的 探讨核酶在细胞内抑制乙型肝炎病毒基因表达的作用。方法 计算机设计针对Ｃ基因的三个切点的核酶Ｒｚ１,Ｒｚ２,Ｒｚ３,合成核酶基因并将三个核酶基因两两组合克隆入ｐＧＥＭ７ｚｆ（一）质粒中,经体外转 录后切割靶ＲＮＡ;选择Ｒｚ２和Ｒｚ３串联的双位点核酶基因构建入逆转录病毒载体ｐＢＢＳ２１２中,重组质粒转染２．２．１５细胞,ＥＬＩＳＡ方法惭型肝炎病毒基因表达的抑制作用。结果 三种不同组合的核酶均可有     

c—myc基因特异核酶的设计及其对靶mRNA的切割

目的：针对ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列设计核酶，探讨生理温度下核酶的切割活性，方法：计算机模拟分析ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分二级结构，选择核酶切位点，设计核酶，分别构建ｃ－ｍｙｃ基因第二外显子部分序列和核酶体外转录载体并经双脱氧末端终止法测定核酶序列正确无误，体外转录核酶和靶ＲＮＡ分子，生理温度下测定核酶切割活性，结果：所设计的核酶可有效地切割靶ｍＲＮＡ分子。结论：所设计的核酶在生理温度下具     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

In Vitro Biological Activity of Anti-C Ⅱ TA Hammerhead Ribozyme——A Novel Approach for Autoimmune Diseases

Dozensofstudieshavedemonstratedthattheab normalexpressionofmajorhistocompatibilitycomplex(MHC)Ⅱmoleculeswasassociatedwithmanydis eases ,suchasrheumaticarthritis ,immunohepatitis ,autoimmunediseaseofcentralneuralsystem[1- 3] .Morerecently ,anti nucleicacidofMHCⅡmoleculeswasshowntoinhibittheexpressionofMHCⅡmolecules,buttheinhibitoryeffectivenesswaslessthan 30 % .Therearecodominanceandmultipleal leleforMHCⅡmoleculeswhichleadtotheircompli catedpolmorphism ,soitisdifficulttorepressexpres si…     

抗乙型肝炎病毒特异联合型核酶的体外切割作用

目的：探讨单一及多位点核酶对乙型肝炎病毒靶ＲＮＡ的切割作用。方法：利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶及特异联合型核酶,构建三个核酶各自及三个核酶串联的自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１２３）观察单一及串联核酶（Ｒｚ１２３）对靶ＲＮＡ的切割作用。结果：构建的串联核酶自剪切转录载体体外转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪切靶ＲＮＡ,串联     

乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响

惭型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。方法 利用计算机辅助设计针对乙型肝炎病毒Ｃ基因的三个单一核酶构建Ｒｚ１核酶自剪切转录载体（ｐＧＥＭＲｚ１）,观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒观察单一核酶（Ｒｚ１）对靶ＲＮＡ的切割作用及乙型肝炎病毒蛋白对核酶剪切作用的影响。结果 核酶自剪切转录载体体２上转录后,在顺式核酶发生自剪切后可将目的核酶正确地释放出来,计算机设计的单一核酶体外可剪     

抗c—erbB—2 ribozyme的计算机设计

设计能特异性切割人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ的核酶。概据Ｓｙｍｏｎｘ的“猛士锤头结构”,以人癌基因ｃ－ｅｒｂＢ－２ｍＲＮＡ为靶ＲＮＡ,用计算机对其可能为核酶切割的位点进行分析以寻找最佳切点。对底物及核酶的二级结构进行预测。     

针对bcr-abl融合基因不同位点的三个单核酶体外切割活性的比较

目的：针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合基因设计并构建了３个针对不同位点的特异性单核酶体转录载体,通过体外切割试验比较其对ｂｃｒ－ａｂｌ合基因的切割效率,为慢粒基因治疗打下基础。方法：（１）首先针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点设计,合成３个相邻的锤头状核酶,将其定向克隆入改建的ｐＤＥＳ载体中,构建３个单核酶体外转录载体并进行序列测定。（２）同时通过ＰＣＲ方法扩增ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点３７６ｂｐ序列,克隆人ｐＢｌｕｅ     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

10-23 DNA enzyme对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的切割活性

目的:探讨10-23 DNA enzym e对乙型肝炎病毒C基因体外转录产物的特异切割活性。方法:设计并合成3种能针对乙型肝炎病毒C基因开放阅读框A1816UG的特异性脱氧核酶,分别命名为D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9。应用体外转录的方法获得相应的底物RNA,观察D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9对其的体外切割效应。以D rzBC-9为例,观察不同浓度的M gC l2对体外切割效率的影响,根据L inew eaver Burk作图法,计算相关的酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km。结果:通过体外转录获得用于切割反应的底物RNA,其大小为300 nt。在特定的切割条件下,D rzBC-7、D rzBC-8和D rzBC-9均能对相应的底物RNA进行有效的切割,切割产物分别为109 nt和191 n。t以D rzBC-9为例,在切割反应体系中缺乏M gC l2时,未见有切割反应。M gC l2浓度在150 mm o.lL-1时达到最高切割效率,再提高M gC l2的浓度,切割效率未见明显增大。酶动力学参数Km、K cat和K cat/Km分别为1.4×10-9m o.lL-1,1.6 m in-1和1.1×109m o.lL-1.m in-1。结论:针对乙型肝炎病毒C基因的10-23 DNA enzym e在体外对相应的转录产物有特异切割作用。     

<Emphasis Type="Italic">In vitro</Emphasis> biological activity of anti-C II TA hammerhead ribozyme—A novel approach for autoimmune diseases

Summary This study investigated the feasibility of using an hammerhead ribozyme against C II TA, a major regulator of MHC II antigens, to repress the expression of MHC II molecules on Hela cells. A hammerhead ribozyme (Rz464) specific to 463–465 GUC triplet of C II TA and its target gene were transcribed, then mixed up and incubatedin vitro. The cleavage products were analyzed by PAGE and silver-staining. Rz464 was then inserted into the pIRES2-EGFP vector (pRz464). Stable transfectants of Hela with pRz464 were tested for class II MHC induction by recombinant human interferon-gamma (IFN-γ). mRNA of C II TA was measured by RT-PCR. Our results showed that Rz464 could exclusively cleave C II TA RNA. When induced with IFN-γ, the expression of HLA-DR,-DP,-DQ on pRz464⁺ Hela was induced, and the mRNA content of C II TA decreased too. It is concluded that Rz464 could inhibit C II TA and thus the family of genes was regulated by C II TA: MHC II molecules. These results provided insight into the future application of Rz464 as a new nucleic acid drug against auto-immune diseases. LIU Fang, female, born in 1976, Postgraduate Student This project was supported by the Key Sub-projects of Science and Technology Development Fund of Shanghai Municipality (No. 00DJ14001-8).     

以U1小核核糖核酸为靶向基因构建 HCV特异性嵌合体核酶

目的：以人类U₁小核核糖核酸为载体,构建特异性嵌合体核酶,以期用于HCV感染的基因治疗。 方法：将HCV特异性核酶序列设计为引物序列一部分,以人类U₁小核核糖核酸为模板,经PCR法及2次克隆得到嵌合体,使核酶序列替代U₁结构中第3个茎-环。 结果：经测序证实新建质粒中确实有核酶序列且替代了第3个茎-环。 结论：以U₁小核核糖核酸为靶向基因可以构建出HCV特异的U₁嵌合体核酶。     

抗肿瘤多药抗性核酶转录质粒的构建及其体外切割研究

目的 探讨体外核酶对肿瘤多药抗性相关基因mdr1靶RNA分子的切割作用及其影响因素。方法 利用计算机软件设计能特异切割mdr1 mRNA的锤头状核酶（ribozyme）,并构建抗mdr1-ribozyme和靶分子的体外转录质粒,进行体外切割实验。结果 发现抗mdr1-ribozyme能较好地切割mdr1 mRNA。 结论 抗肿瘤多药抗性核酶的体外研究为其体内应用提供了参考,ribozyme有可能成为逆转肿瘤多药抗性的新药物。     

丙型肝炎病毒核心基因靶向性M1GS核酶的构建及鉴定

目的 构建一种具有丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)靶向性的M1GS核酶,为进一步研究引导序列(guide sequence,GS)引导核酶P在RNA水平阻断HCV核心基因(core gene,C)的表达作前期基础.方法 选择HCV基因组中序列相对保守且在病毒复制过程中起关键作用的核心基因作为靶...     

抗HPV16E7－ribozyme的体外制备与活性鉴定

通过体外转录结合乙醇沉淀，建立了体外大量制备抗ＨＰＶ１６Ｅ７－Ｒｚ的方法。切割实验表明，ｒｉｂｏｚｙｍｅ可在体外准确和有效地切割Ｅ７靶ＲＮＡ，形成８５ｎｔ和８６ｎｔ大小的切割产物。体外制备的ｒｉｂｏｚｙｍｅ的切割活性、Ｋｍ和ｋｃａｔ值与人工合成的相似。结果说明，体外制备的ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ具有特异的催化切割活性。     

RNase P体外靶定切割人巨细胞病毒UL54 mRNA片段研究

目的：观察大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外水平上对人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）DNA聚合酶UL54 mRNA的切割效果,探讨核酶作为新型抗病毒制剂的应用前景。方法：针对HCMVUL54 mRNA设计特异性的外部引导序列（external guide sequences,EGSs）EGS-T6,观察其引导M1 RNA特异的细胞外切割活性。结果：在EGS-T6引导下,大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外可特异地对靶mRNA进行有效切割。结论：EGS-T6具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。     

Bridge Sequence对M1GS核酶体外切割活性的影响

目的探讨B ridge Sequence(桥序列)对M1GS核酶体外切割活性的影响,从而为人工M1GS核酶的优化设计提供一定的理论依据。方法以含大肠杆菌核酶P催化单位(M1 RNA)基因的pFL117质粒作为模板,通过巧妙设计不同的下游引物,经PCR扩增、扩增产物克隆及克隆基因的体外转录,构建一组具有不同桥序列的人工M1GS核酶。进一步将所构建的上述人工M1GS核酶分别与同位素标记的底物RNA片段进行体外切割试验,并通过同位素扫描成像系统对各M1GS核酶的切割产物加以分析。结果成功构建了针对HCMV UL54mRNA T7靶位的、四种不同桥序列长度的M1GS核酶,其桥序列长度分别为0n、t6nt、20nt和88nt,并依次命名为M1GS-T7(0)、M1GS-T7(6)、M1GS-T7(20)和M1GS-T7(88)。经体外切割试验证实,M1GS-T7(88)的靶向切割活性最强,M1GS-T7(20)的切割活性相对较弱,而M1GS-T7(0)及M1GS-T7(6)则无明显的切割活性。结论人工M1GS核酶中桥序列的长度对于其体外切割活性具有重要影响,提示在人工M1GS核酶的优化设计时,桥序列的长度是不可忽视的因素之一。     

AIV PB2基因靶向性M1GS核酶的构建及其体外切割活性测定

目的 针对禽流感病毒(AIV)复制酶PB2亚基的基因构建具有靶向切割作用的M1GS核酶,为新型抗AIV反义药物的开发奠定基础.方法 基于大肠埃希菌的核糖核酸酶P(RNase P),根据AIV PB2基因的序列特征,设计一小段与之互补的引导序列GS,通过PCR技术将其共价连接至大肠埃希菌RNase P催化性亚基(M1 RNA)的3'末端,以构建靶向性M1GS核酶.通过体外切割试验测定M1GS核酶的活性.结果 构建了M1GS-T436、M1GS-C341两种M1GS核酶.体外切割实验证实,核酶M1GS-T436可对靶RNA片段产生特异性切割;核酶M1GS-C341虽可切割靶RNA片段,但可能属于非特异性切割.结论 成功构建并筛选出一种具有显著体外切割活性的M1GS核酶(M1GS-T436),为今后进一步研究其胞内及体内抗病毒活性奠定了基础.