乙型肝炎病毒转基因小鼠中外源基因整合的检测

目的：了解乙型肝炎病毒ＤＮＡ序列在乙型肝炎病毒转基因小鼠中的整合情况。方法：用头尾相接的乙型肝炎病毒全序列基因，通过原核显微注射法产生转基因小鼠，用Ｃ区特异性引物扩增鼠尾ＤＮＡ检测整合，对其中１０只阳性鼠的扩增产物测序。结果：１２８只仔鼠中，１４只整合阳性。对１０只阳性鼠测序，９只与所转基因序列完全相同，１只在１７３９、１７４０位缺失两个碱基。结论：外源乙型肝炎病毒基因确实整合至小鼠基因组，多数为     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心基因转基因小鼠。方法：构建乙型肝炎病毒核心基因真核表达载体pcDNA3-HBc;采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核巾,然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管;取其产10d龄子代鼠进行鉴定。结果与结论：表达载体内切酶酶切及序列分析结果与预期一致;PCR鉴定转基因阳性小鼠比例为25％(6／24)。可表达核心蛋白基因的转基因小鼠成功建立。     

β防御素2转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌感染的研究

目的探讨转基因小鼠抗金黄色葡萄球菌作用。方法用分子克隆方法构建β防御素2（HBD-2）全长cDNA重组质粒,通过显微注射技术,将重组片段注射入小鼠雌原核细胞,聚合酶链反应（PCR）方法检测小鼠HBD2基因整合情况,免疫组化检测转基因小鼠HBD2表达和组织分布。用金黄色葡萄球菌腹腔攻击转基因阳性小鼠观测全身情况和死亡数。结果DNA序列测定证明重组质粒插入HBD-2cDNA片段无误,PCR显示7只小鼠已整合HBD-2基因,PCR阳性小鼠免疫组化显示HBD2基因在肺、肠道、肝、肾、睾丸、小脑等组织广泛表达。腹腔攻击实验显示7只转基因小鼠4只存活,而野生小鼠10只全部死亡。结论HBD-2在体内具有显著抗金色葡萄球菌感染能力。     

人β2m转基因小鼠的制备、筛选及鉴定

目的:制备人β2m转基因小鼠,研究HLA-B2704的表达.方法:应用显微注射将人β2m基因注入C57BL/6×昆明鼠和昆明鼠×昆明鼠F1代受精卵,出生动物及其后代经PCR筛选,采用斑点杂交和Southern杂交对阳性鼠基因组DNA标本行进一步鉴定和测定整合拷贝数,利用RT-PCR检测阳性鼠中人β2m转基因的表达.结果:6只原代仔鼠及7只它们的下一代(F1)带有人β2m基因.由微注射基因后移卵出生的86只小鼠中,C57BL/6×昆明鼠杂交仔鼠35只,其中4只阳性(11.4%),昆明鼠×昆明鼠杂交仔鼠51只,其中2只阳性(3.9%),含有人β2m基因的原代鼠×昆明鼠杂交仔鼠20只,其中7只阳性.整合的转基因均为单拷贝.Southern杂交证实上述阳性鼠确有转基因整合.阳性鼠的皮肤、结肠、睾丸和脾脏组织中均有人β2m转基因mRNA的表达.结论:在转基因动物制备中,C57BL/6×昆明鼠F1代明显优于昆明鼠×昆明鼠F1代.与人HLA-B2704基因相比,人β2m基因不易整合,其整合率与整合拷贝数均较低.得到的人β2m转基因小鼠能够将人β2m基因传给下一代并可与人HLA-B2704转基因鼠交配.     

人乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立

目的 建立人乙型肝炎病毒ｘ（ＨＢｘ）基因转基因小鼠模型。方法 用显微注射法制备转基因小鼠,用分子杂交法鉴定转基因小鼠ＨＢｘ的整合与表达。结果 建立了人ＨＢｘ的基因转基因小鼠模型。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定得到１７只转基因首建鼠。逢肝脏提取总ＲＮＡ进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交,结果显示１７只首建鼠肝脏中均有ＨＢｘ表达。结论 为从整体水平研究慢性乙肝炎患者诱发肝癌的作用机制及ＨＢｘ的反式激活作用机制提供了     

EB病毒早期基因BHRF1转基因小鼠纯合子建立及建系

目的构建整合有EB病毒(EBV)早期基因BamHI-H右向读码框1(BHRF1)基因纯合子转基因小鼠。方法通过显微注射技术构建BHRF1阳性首建鼠F0共16只,将转基因小鼠与正常小鼠交配,得到子代F1小鼠,PCR技术检测子鼠鼠尾组织DNA,鉴定筛选BHRF1阳性鼠。阳性鼠再与同系阴性鼠杂交得到F2小鼠,筛选出F2小鼠中的阳性鼠近交得F3小鼠。筛选出F3小鼠中的纯阳性鼠进行近交,得到纯阳性F4小鼠。F4小鼠再近交得到纯阳性F5小鼠。结果经PCR及测序证实,F4、F5小鼠均为BHRF1阳性鼠,测序结果经blast比对,与BHRF1基因完全相同。结论本实验首次建立了BHRF1转基因鼠模型,并成功筛选出纯阳性BHRF1转基因小鼠,为深入研究BHRF1的生物学特性及其在EBV相关肿瘤发生发展中的作用提供了理想的动物模型。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件，TNNI2基因的第175个氨基酸缺失，通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠，获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测，tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合，建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

异种肝移植模型-转人CD59蛋白基因小鼠的建立

目的　通过显微注射法产生用于异种移植研究的表达人CD5 9蛋白的转基因小鼠模型。方法　实验中利用OMT作为目的基因hCD5 9cDNA的启动子 ,CMV作为报告基因GFP的启动子 ,构建重组质粒 pGOC。通过显微注射法 ,把CMV GFP OMT CD5 9基因片断注射入昆明白小鼠受精卵。结果　产生出 86只F0 代转基因小鼠。鼠尾基因组DNA经PCR法检测 ,12只阳性 ,进一步用Southernblot法检测 1只阳性。结论　通过显微注射法 ,外源基因hCD5 9cDNA在小鼠基因组中得到整合 ,产生出了阳性转人CD5 9蛋白基因小鼠 ,可用于进一步异种移植研究     

异种移植动物模型-转人CD59 cDNA首建小鼠的培育

目的　培育转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,以进一步研究异种移植 ,并为建立鼠系奠定基础。方法　构建转基因结构pEGFP -C1-OMT -CD5 9,限制性内切酶切除质粒载体 ,回收、纯化包括人CD5 9cDNA、绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein ,GFP)基因及各自启动子的约 3 .3kb的基因片段 ,用显微注射法将此片段注入小鼠受精卵 ;提取F0 代小鼠尾组织DNA ,用PCR法初选 ,再用Southern杂交法对PCR阳性鼠进一步筛选 ,确定阳性转基因首建小鼠。结果　共注射 5 90枚受精卵 ,移植于 2 4只受体母鼠中 ,出生F0 代小鼠 73只 ;PCR初选有 8只呈阳性(6♂∶2♀ ) ,Southern杂交有 2只呈阳性 (1♂∶1♀ ) ;经粗略估算 ,整合外源基因拷贝数分别为 3和 10。结论　成功地培育出转人CD5 9cDNA首建小鼠 ,用PCR和Southern杂交法证实了外源片段的整合     

乙型肝炎病毒纯合子转基因小鼠(adr 1.2)的培育

目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。 目的：通过遗传学育种使外源基因整合位点随机的HBV转基因小鼠成为单一整合位点的纯合子转基因小鼠。方法：产生founder小鼠以后,将正常小鼠与转基因小鼠交配,通过PCR,Dot-blotting,Southern-blotting等方法检测 HBV DNA在转基因小鼠体内的整合状况,阳性率达50％左右后,进行近亲交配。结果：共得到了7代HBV转基因小鼠,其中包含有整合HBV基因纯合子的转基因小鼠。结论：外源基因在转基因小鼠体内可以稳定遗传,并得到了整合有HBV基因的纯合子转基因小鼠。     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。     

HBV转基因在C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU3小鼠基因组中的整合分析

目的:分析HBV转基因在乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系基因组中的整合特征.方法:以F6～F17代乙肝转基因小鼠C57 TgN(HBVadr2.0)SMMU为研究对象,采用基因组DNA PCR、Southern印迹和DNA测序的方法,分析HBV转基因在该品系转基因小鼠基因组中的整合特征.结果:PCR分析显示,F6～F17代乙肝转基因小鼠基因组中均已稳定整合了相同拷贝数的HBV转基因,整合的HBV DNA可通过生殖系在世代间稳定遗传.整合在转基因小鼠基因组中的HBV DNA含有HBVpres、s、c、x基因,Southern印迹证实HBV转基因含有全长HBV基因组DNA,DNA测序结果表明,该品系转基因小鼠所整合的转基因为adr亚型的HBV DNA.结论:C57-TgN(HBVadr2.0)SMMU"3号"品系转基因小鼠基因组中均整合有adr亚型的全长HBV基因组DNA,从DNA水平证实该转基因小鼠品系已具备了乙肝实验动物模型的基本条件.     

乙型肝炎转基因小鼠品系C57-TgN(HBV adr2.0)SMMU的生物学特征

目的：评价乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU生物学特征的稳定性。方法：以F6代乙肝转基因小鼠C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU为研究对象，采用基因组DNA PCR，血清ELISA检测，Western印迹分析，免疫组织化学，血清DNA PCR，透射电镜和H－E染色的方法分析HBV基因在转基因小鼠中的整合，表达，复制和组织这变化。结果：F6代乙肝转基因小鼠基因组中稳定整合有HBV基因，肝组织中可检测用HBsAg,HBcAg和X蛋白3种病毒蛋白，血清中HBsAg和HBeAg的表达率分别为19．54％和3．39％，且在血清和肝组织中存在病毒NA和病毒样颗粒；长期的病毒DNA整合，表达和复制可以引起转基因小鼠肝，肺等组织的病理性损伤。结论：乙肝转基因小鼠品系C57－TgN(HBV adr2.0)SMMU具有基因组中稳定整合病毒DNA，血清和肝组织中有病毒蛋白表达和病毒复制的特征，并具有一定的组织这变化，作为生物医药研究的实验动物模型具有推广应用价值。     

HBV转基因小鼠体内淋巴细胞表型特点及干扰素α对其的影响

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）转基因小鼠体内淋巴细胞表型特点及干扰素α对其病毒学指标和免疫细胞表型的影响。 方法选取HBV 转基因小鼠和野生型（WT）小鼠,采用ELISA检测HBV转基因小鼠血清HBsAg和HBcAb水平及两组小鼠血 清IL-21及IL-6水平,分离肝、脾以及外周血淋巴细胞,流式细胞术检测CD4+T和CD19+B细胞频数;给予9只HBV转基因小鼠 重组鼠源性干扰素α（rmIFN-α）皮下注射,同时9只HBV转基因小鼠相应注射PBS,观察其血清HBsAg、HBV DNA、IL-6、IL-21 水平的变化以及外周血CD4+T和CD19+B细胞频数变化。结果HBV转基因小鼠的血清HBsAg水平较高并能检测到HBcAb, 其血清IL-21及IL-6水平较WT小鼠显著升高（P<0.05）;HBV转基因小鼠外周血、肝脏以及脾脏淋巴细胞中CD4+T细胞频数较 WT小鼠均明显低下（P<0.05）,但其肝脏CD19+B细胞频数明显高于WT小鼠（P<0.05）;HBV转基因小鼠肝内CD4+T细胞频数 与血清HBsAg水平呈负相关,而肝内CD19+B细胞频数与血清HBcAb水平呈正相关;rmIFN-α处理可显著提高HBV 转基因小 鼠外周血CD4+T和CD19+B细胞频数以及血清IL-6水平（P<0.05）。结论HBV转基因小鼠体内淋巴细胞亚群频数异常,外源性 干扰素α可通过调节淋巴细胞亚群频数发挥免疫调节作用。     

乙型肝炎病毒（ayw型）转基因小鼠的建立

目的：建立遗传上稳定的、带有乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）ａｙｗ亚型的转基因小鼠品系。方法：通过对受精卵显微注射进行基因转移的途径制备转基因小鼠，以ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂产、ＥＬＩＳＡ、组织切片免疫组化和透射电镜等方法，分析所导入ＤＮＡ在转基因小鼠体内的功能情况。结果：得到２１只建立者小鼠，在它们的血清中检测到了ＨＢｓＡＧ和ＨＢｅＡｇ的存在，还在肝细胞中观察到了ＨＢＶ样病毒颗粒。结论：ＨＢＶ基因组ＤＮ     

复制型HBV转基因小鼠的遗传与繁育研究

本文采用类似系祖建系的方法，对复制型ＨＢＶ转基因小鼠模型的１７、２１、２５三个系列进行了繁育，通过ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分子杂交的方法，检测三个系列小鼠尾组织和血清的ＤＮＡ样品，以确定ＨＢＶ基因的整合和复制情况。结果表明，ＨＢＶ基因已稳定地遗传至第五代（Ｆ５），且各世代小鼠血清中都存在ＨＢＶＤＮＡ，此外，整合阳性小鼠的血清中能测出ＨＢＶＤＮＡ的比率很高，Ｆ１代为９４．４４％（１０２／１０８），Ｆ２、Ｆ３代为９５．３１％（６１／６４），故在繁育中可以通过测血清中的ＨＢＶＤＮＡ来确定小鼠是否整合。     

Hepatitis B virus S gene mutants in infants infected despite immunoprophylaxis

Objective　To assess the correlation between hepatitis B virus (HBV) surface gene mutant infection and hepatitis B (HB) vaccination failure. Methods　Using sera from 106 infants who were born to HBV carrier mothers and failed in HB immunoprophylaxis, HBV S gene was amplified by PCR, transferred to nylon membranes for Southern blots, and then hybridized with oligonucleotide probes. Eleven of non-hybridizing samples were used for DNA sequencing. Results　93.4% (99/106) of the samples were HBV DNA positive, and 30.3% (30/99) failed to hybridize with at least one of the four probes. DNA sequencing confirmed that 10 of the 11 samples had an S gene mutation with amino acid (aa) change. The identified mutants included nucleotide (nt) 546T→A(aa131N→T), nt531T→C (aa126I→T), nt491A→C (aa113T→P), nt491T→A (aa113S→T), nt533C→A (aa127P→T), nt581T→A (aa143S→T), nt636A→T (aa161Y→F), and nt679A→C (aa175L→F). The sequence in one mother-infant pair was completely the same, with mutations at aa131 and aa161. Conclusions　The prevalence of HBV surface mutants is about 30% in the children failing in HB vaccination. HBV mutants can infect infants by maternal-infant transmission.