培养的人骨髓间充质干细胞向成骨细胞、脂肪细胞分化

目的探讨体外培养的人骨髓间充质干细胞(MSCs)向成骨细胞、脂肪细胞分化的方法,以及钙结节形成、Ⅰ型胶原表达等情况. 方法分离人骨髓间充质干细胞,经过原代培养和传代培养,分别加入成骨诱导、脂肪诱导培养体系,经过倒置显微镜观测与HE染色了解诱导后细胞形态变化,并通过von Kossa染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、苏丹黑染色与油红O法染色鉴定细胞的性质.另取2代细胞体外培养,加入成骨诱导分化试剂,以碱性磷酸酶(ALP)为检测指标计数细胞阳性率,比较成骨诱导1、2、3、4周时细胞碱性磷酸酶的变化.结果体外培养的MSCs在合适的条件下能够向成骨细胞、脂肪细胞分化.细胞经成骨诱导2～3周时细胞碱性磷酸酶阳性率最高,达到85%.结论 MSCs体外培养在一定条件下向成骨细胞、软骨细胞与脂肪细胞分化,体外培养时形成钙结节,并表达Ⅰ型胶原.培养2～3周后细胞经成骨诱导分化细胞ALP阳性率较高.     

兔骨髓间充质干细胞培养与多向分化潜能鉴定的实验研究

目的原代培养兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs),观察体外培养中MSCs的生物学特性及多向分化潜能。方法通过密度梯度离心联合贴壁培养法,体外分离、纯化、扩增兔骨髓间充质干细胞,观察形态学特点,测绘传代MSCs生长曲线,检测细胞周期及表面标记,体外诱导MSCs向成骨细胞、成脂肪细胞分化并鉴定。结果原代及传代MSCs为长梭形成纤维细胞样细胞;生长曲线显示传代细胞具有类似的生长规律;流式细胞仪分析MSCs CD44表达阳性,CD45表达阴性;细胞周期分析显示87%以上细胞处于G0/G1期;经成骨细胞诱导,细胞碱性磷酸酶染色阳性;经成脂肪细胞诱导,细胞内出现红染脂滴。结论通过密度梯度离心联合贴壁培养法可大量扩增、纯化MSCs,所获细胞具有高度自我更新和多向分化潜能。     

体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法由人脐静脉获得MSCs,纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导,扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后,MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。     

特定微环境下诱导脐血间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 在体外分离培养人脐血间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs),探讨脐血间充质干细胞体外培养生长特性及向神经细胞分化的诱导条件.方法 在体外将脐血MSCs进行向神经细胞的定向诱导,观察脐血MSCs的形态变化,并在诱导后第5天用免疫荧光染色检测脐血MSCs中神经元细胞特异性的标志物;并与单纯低糖DMEM培养基培养的对照组脐血MSCs相比较.结果 诱导组中的脐血MSCs生长伸展,形成突起,呈放射状,并可互相形成连接,免疫荧光显示特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase,NSE)阳性,表现出神经元细胞的特性.而对照组中的脐血MSCs未形成神经样形态结构,免疫荧光NSE阴性.结论 脐血MSCs可在体外经化学方法 定向诱导分化为神经细胞,可应用于神经修复及再生等领域.     

脐血间充质干细胞分离、培养与鉴定

目的研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(MSCs)体外分离、培养条件,探讨其作为种子细胞用于下一步实验研究的稳定性与实用性.方法无菌条件下取正常足生产的脐带血,经CPDA-1复合抗凝剂抗凝,然后经过去红细胞处理,再用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,DMEM/F12培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,采用定向诱导分化方法检测鉴定获得的MSCs.结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态,但偏向半月形弯曲状,经过成肌、成脂肪、成骨细胞诱导分化成功后确定为间充质干细胞.结论脐血来源的间充质干细胞能够在体外分离、培养出有用的进一步实验所需要的种子细胞.     

兔自体骨髓间充质干细胞移植修复关节软骨缺损的研究

目的:研究将体外培养的兔骨髓间充质干细胞(MSCs)定向诱导分化为成骨细胞的方法, 探讨其作为组织工程化骨的种子细胞的可行性.方法:采用Percoll分离液,从兔的骨髓组织中分离骨髓间充质干细胞,用低糖型的DMEM( Dulbecco's modified Eagle's medium)培养液中添加成骨诱导剂地塞米松、β-甘油磷酸钠及抗坏血酸进行培养.诱导2周后钙-钴法染色检测碱性磷酸酶(ALP)表达, 诱导4周后VonKos-sa染色检测钙结节形成.结果:第3代兔MSCs呈典型的成骨细胞形态,诱导2周ALP染色阳性率达80%,诱导4周后VonKossa染色可见钙结节形成.结论:经过分离纯化后的兔骨髓基质细胞在体外培养条件下可以分化为成骨细胞.     

人脐血间充质干细胞分离培养方法的改良

目的探讨一种新的能提高脐血间充质干细胞体外分离培养成功率的方法。方法利用Ficoil分离脐血,采用改良的密度梯度两步离心法分离脐血单个核细胞,接种于含20％胎牛血清和5％人脐血血清的原代培养液中,在倒置相差显微镜下进行形态观察,直接免疫荧光法检测人脐血间充质干细胞相关抗原CD29的表达。加入成骨诱导剂体外诱导脐血间充质干细胞10d碱性磷酸酶染色鉴定其成骨分化能力。结果本实验方法成功分离培养出人脐血间充质干细胞。原代培养第4天即可见到有成纤维样细胞贴壁,10d左右集落形成,约25d进行传代。传代后生长加速,一周左右即可长满,免疫荧光检测显示脐血间充质干细胞相关抗原CD29呈阳性表达,成骨诱导10d碱性磷酸酶染色阳性。结论利用改良的密度梯度离心法可获得人脐血间充质干细胞．     

同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养及多向分化潜能鉴定

目的 探讨同种异体大鼠骨髓间充质干细胞在体外的共培养,并行多向分化诱导鉴定。方法 分别通过全骨髓直接培养法及密度梯度法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,各传至第3代后,取等量细胞,混合后共培养,共培养之细胞再次传代后,分别进行成骨细胞、成脂肪细胞诱导,并分别行碱性磷酸酶、Von Cossa及油红染色鉴定。结果 全骨髓直接培养法原代细胞形态不均一,但是增殖能力好;密度梯度法分离得到的细胞较为均一,但增殖力不如全骨髓直接培养法。经过3代传代后,细胞均可获得相对纯化。共培养细胞增殖力较好,细胞形态较为均一,且未出现因免疫排斥导致的细胞死亡。共培养之大鼠骨髓间充质干细胞分别经诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞形态（分别经碱性磷酸酶、Von Cossa染色和油红染色证实）。结论 采用全骨髓直接培养及密度梯度离心法,经3-5代培养后均可获得相对纯化之骨髓间充质干细胞。同种异体大鼠骨髓间充质干细胞共培养生长良好,不发生免疫排斥,证实该类细胞的免疫原性极低。在体外,大鼠骨髓间充质干细胞可诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞,表明它具有多向分化潜能。     

大鼠骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外诱导分化为成骨细胞的模型。方法：分离大鼠骨髓间质干细胞进行体外培养，观察其生物学特性。并选用一定的诱导剂诱导成骨细胞，通过形态学变化、碱性磷酸酶染色及钙沉积对成骨细胞进行鉴定。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形，成骨细胞诱导后MSC细胞形态由长梭形向多边形转变，ALP染色阳性，Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征。结论：大鼠骨髓MSCs体外能被诱导分化为成骨细胞，为骨组织工程研究的优良种子细胞。     

miR-30a-5p在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中的生物学功能及验证

目的：探讨并验证重组miRNA-30a-5p体外转染对人骨髓间充质干细胞（MSCs）向成骨细胞分化的生物学作用。方法：人工重组合成从人骨髓MSCs定向成骨分化差异性表达miRNA基因芯片结果中筛选成骨性表达量显著增高的miRNA-30a-5p。从人体骨髓中分离培养MSCs,成骨诱导分化过程中于体外转染重组miRNA-30a-5p,并通过茜素红S法染色检测钙盐沉积、碱性磷酸酶（ALP）钙钴法染色及ALP比色法定量检测成骨细胞ALP活性,对比观察研究重组miRNA-30a-5p在人骨髓MSCs定向成骨诱导分化过程中的生物学功能。结果：成功分离培养人骨髓MSCs并诱导其成骨定向分化。经体外向MSCs转染miRNA-30a-5p并诱导其成骨定向分化,转染效率为（37.32±2.43）%。分别于诱导培养第14、21天行ALP染色观察、ALP活性测定、茜素红钙盐结节染色检测各组细胞成骨活性,结果显示miRNA-30a-5p mimics转染组MSCs成骨分化特性显著性增强（P〈0.05）。结论：miRNA-30a-5p在MSCs定向成骨分化的过程中具有一定的促进增强作用,被转染的MSCs向成骨细胞定向分化表达有所增加,为进一步阐明人骨髓MSCs定向成骨分化的分子生化机制,细胞移植修复治疗骨缺损奠定了理论基础。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养及初步鉴定

目的探讨并建立一种简便有效的体外分离纯化及扩增大鼠骨髓间质干细胞的方法,并研究其生物学特性,对其进行初步鉴定,为进一步诱导分化为胃黏膜上皮细胞奠定基础。方法利用贴壁培养法分离纯化SD大鼠骨髓间质干细胞,体外培养,传代扩增,在倒置显微镜下连续观察细胞的形态变化,并用免疫组化方法鉴定骨髓间质干细胞表面CD29,CD44,CD34的表达。将加入成骨、成脂肪诱导剂的骨髓间质干细胞体外培养2～3周,观察细胞形态变化,并做油红0染色,鉴定成骨及成脂肪分化的结果。结果原代培养8—10d后可分离得到骨髓间质干细胞,且骨髓间质干细胞体外培养生长状况良好,呈均一的成纤维细胞样,传代周期为3～4d。免疫组化显示90％以上的骨髓间质干细胞CD29、CD44阳性,CD34阴性,且可以将其定向诱导为脂肪细胞和成骨细胞。结论利用贴壁培养法可分离培养出大量大鼠骨髓间质干细胞,且此方法简便易行。     

TGF-β2和geneX对BrdU标记骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的作用

［摘要］ 目的　研究TGF-β2和geneX对BrdU标记的骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化作用的影响．方法　采用全骨髓贴壁培养法分离骨髓间充质干细胞,传代并鉴定,设实验组和空白对照组,实验组分4组:A组:BrdU标记后的BMSCs组;B组:BrdU标记后的BMSCs+TGF-β2组;C组:BrdU标记后的BMSCs+geneX组;D组:BrdU标记后的BMSCs+geneX+TGF-β2组．空白对照组为BrdU标记后的单纯BMSCs加入基础培养基避光培养．诱导培养后观察骨髓间充质干细胞生长形态、检测生长动力学（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）、碱性磷酸酶（ALP）和钙定量、进行细胞Von-Kossa法染色,观察成骨分化作用．结果　（1）4组BMSCs吸光度值（OD）分析比较显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（2）各组BMSCs成骨诱导后碱性磷酸酶（ALP）和钙定量检测结果显示:细胞组间差异有统计学意义（P＜0.05）;（3）进行细胞Von-Kossa法染色,D组可见大量钙结节;C组可见较多钙结节;B组可见部分钙结节;A组可见少量钙结节;空白对照组未见钙结节．结论　（1）TGF-β2可促进骨髓间充质干细胞的增殖和诱导其向成骨细胞分化;（2）geneX可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,且在细胞因子TGF-β2联合作用下成骨分化作用更明显．     

负载TGF-β1微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的研制负载转化生长因子β1（transforming growth factor—β1,TGF—B。）壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）体外构建组织工程软骨,观察将其移植修复兔膝关节软骨缺损的效果。方法通过密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化MSCs,以抗兔CD14、CD44等单抗采用流式细胞仪进行MSCs表面抗原鉴定,获得纯化的MSCs。采用乳化交联法获得包裹TGF—B,壳聚糖缓释微球,并将该微球负载在冷冻干燥获得的壳聚糖一丝素支架上。将培养的MSCs种植到支架上,体外构建组织工程软骨,移植到兔关节软骨缺损处。移植空白支架的为实验对照组,移植体外构建的组织工程软骨为实验组。主要观察指标,流式检测的MSCs细胞表面标记情况,微球的形态,支架与细胞共培养后电镜下情况,支架移植后的兔关节修复情况及组织学检查。结果流式检测MSCs第4代及第9代细胞的CD14及CD44表面抗原的表达情况发现两代MSCsCD14表达基本呈阴性,CD44表达呈阳性,符合间充质干细胞的特性。扫描电镜观察所制备的微球基本呈球形,表面光滑,直径约为1μm,大小较均一,分散度好。细胞在壳聚糖-丝素三维支架上生长状态良好,电镜观察,可见支架孔隙内有细胞黏附生长。移植治疗后发现实验组修复明显好于对照组,实验组术后3个月实验组已经有较硬的类软骨组织填充修复,切片显示有软骨细胞规则排列,甲苯胺蓝染色为阳性,而对照组仅为纤维组织修复,切片显示为纤维组织或纤维软骨组织修复,软骨细胞排列紊乱,甲苯胺蓝染色阴性或弱阳性。结论负载TGF—β1壳聚糖微球的壳聚糖-丝素支架复合骨髓间充质干细胞体外复合培养后移植治疗修复兔膝关节软骨缺损,具有较好的疗效。     

人脐血间充质干细胞体外分离培养与扩增实验研究

目的探讨脐血来源的人间充质干细胞（HMSCs）在体外分离培养与扩增的可行性。方法在无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经复合枸橼酸钠抗凝,用相对密度为1．077g／L的Ficoll淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以30％胎牛血清进行培养和扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞接种于特定培养基后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,经传几代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达GD14、CD19,强表达CD105、CD44。结论来源于人脐血的MSCs在体外可以分离培养、扩增,为MSCs的进一步研究奠定基础。     

富血小板血浆对骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的影响

目的 观察富血小板血浆（platelet-rich plasma,PRP）对兔源骨髓间充质于细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）定向分化为成骨细胞的作用及机制. 方法 离心法分离兔骨髓后,体外培养BMSCs,体积分数5％和10％的PRP与BMSCs共培养,观察BMSCs诱导分化过程中茜素红染色阳性率,应用酶标仪检测碱性磷酸酶（alkaliphosphatase,ALP）活性,应用ELISA法检测BMSCs诱导分化过程中骨钙素（osteocalcin,OCN）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor,CTGF）的含量,应用real time-PCR检测成骨相关基因CTGF、ALP、成骨细胞核心结合因子α1（core-binding factor alpha 1,Cbf-α1）、兔Ⅰ型胶原（Col-Ⅰ）和OCN的表达. 结果 BMSCs诱导分化后细胞茜素红染色阳性率、ALP活性、OCN及CTGF含量升高,CT-GF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN的mRNA表达增加. 结论 PRP可促进BMSCs向成骨细胞分化,可能与PRP促进BMSCs中CTGF、ALP、Cbf-α1、Col-Ⅰ和OCN表达有关.     

Induced differentiation of adult human bone marrow derived mesenchymal stem cells in vitro toward osteoblasts]

OBJECTIVE: To investigate the feasibility of inducing in vitro mesenchymal stem cells (MSCs) derived from adult human bone marrow differentiate into osteoblasts and potential applicability of the MSCs as the seed cells in tissue engineering. METHODS: Adult human bone marrow was collected from the healthy adult volunteers to obtain the MSCs, which, after in vitro culture in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum and incubation under standard condition, were induced to differentiate into osteoblasts in DMEM containing dexamethasone (1x10(-8) mol/L), beta-sodium glycerophosphate (10 mmol/L) and ascorbic acid (50 mg L). Proliferation and differentiation of the MSCs were observed continually under inverted phase-contrast microscope and transmission electron microscope. The collagen typeI was detected by immunohistochemistry, alkaline phosphatase (AP) in the MSCs stained by Gomori, the calcified nodules were stained by von Kossa method, and the changes in the content of AP were measured. RESULTS: The MSCs proliferated rapidly in in vitro culture and after a 2- to 3-week induction, the cells began to generate large amount of enlarged endoplasmic reticulum, Golgi complexes and mitochondria, with immature cell nuclei. Positive staining for collagen typeIand strong reaction for AP and calcified nodules were observed. Increasing AP secretion by the MSCs was seen as the time of induction prolonged (P<0.01). CONCLUSIONS: Human bone marrow-derived MSCs can be induced to differentiate into osteoblasts through relatively simple procedures, which provide ideal autogenous source of seed cells for bone tissue engineering. The method adopted in this experiment may be used for routine culture of the seed cells for bone tissue engineering.     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC），探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血，分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC，采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形，第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性，而CD34及CD45阴性。诱导6周后，联合诱导组无变化，而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型，并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周，检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外，阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

胎鼠皮肤间充质干细胞的体外培养及成骨分化研究

目的：分离、纯化胎鼠皮肤间充质干细胞(MSCs)，在体外培养、扩增并促其成骨分化，为骨组织工程学研究与骨质疏松症的细胞学治疗提供一种可能。方法：体外培养胎鼠皮肤MSCs，并在培养液中加入成骨诱导剂诱导培养，观察其成骨分化潜能。 结果：胎鼠皮肤MSCs传代培养第15代仍具有增殖能力,说明该细胞为干细胞源性;贴壁细胞在成骨诱导剂作用下,碱性磷酸酶(ALP)水平升高，ALP钙钴染色呈阳性反应，钙结节茜素红染色反应阳性。 结论：胎鼠皮肤MSCs具有很强的自我增殖能力，成骨诱导剂可促其向成骨分化。