人脐血间充质干细胞的改良分离培养

目的探讨人间脐血来源的充质干细胞在体外分离培养与扩增的方法。方法用重力离心-密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离细胞,用含15%FBS的DMEM低糖培养基培养并传代,流式细胞仪检测P3代间充质干细胞的表面标志。结果脐血来源的单个核细胞24 h即开始贴壁,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞。经自然纯化法传代后,可得到形态单一的长梭形间充质干细胞。流式细胞仪检测结果显示该细胞表达CD44。结论脐血来源的MSCs可以在体外分离培养和扩增,细胞表面标记与骨髓来源间充质干细胞一致。     

脐血单个核细胞体外分离和定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞(NSCs)标志物mRNA的表达.方法 使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs),观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达,使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后NSCs标志物巢蛋白(nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达.结果 脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞.流式细胞仪检测该细胞不表达CD34、CD11a、CD11b和强表达CD29,符合MSCs特征.诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强,48h达高峰,然后逐渐减弱.结论 脐血中存在间质干细胞,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志.脐血能够成为NSCs的新来源.     

成人脂肪源间充质干细胞培养上清对人脐血间充质干细胞体外培养及扩增的支持作用

目的：研究人脂肪间充质干细胞培养上清对人脐带血（HUCB）中所含有间充质干细胞（MSCs）的影响。方法：取脐带血,肝素抗凝,Percoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,低糖DMEM培养获得贴壁细胞层。与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育。流式细胞仪检测表面抗原。结果：脐带血的单个核细胞与人脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育经体外培养贴壁后出现形似纤维状细胞形态并表达与MSCs相关的抗原（CD13,CD44,CD71,CD166）,但不表达造血细胞抗原（CD34,CD45）,这与源于骨髓的MSCs一致。结论：人脐血间充质干细胞与脂肪源间充质干细胞培养上清共孵育,对脐血间充质干细胞体外分离培养及扩增有支持作用。     

脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的:探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达,并观察其致瘤性。方法:使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs)。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞(NSCs)标志物巢蛋白(Nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达;收集培养后7d的MSCs,接种于裸鼠皮下,观察是否有增生物的出现,并观察细胞组织形态学变化。结果:脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34,CD11a和CD11b,强表达CD29,符合MSCs特征。诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强(P<0.05),48h达高峰,然后逐渐减弱;细胞接种后12周,在裸鼠皮下不能形成肿瘤,与对照组相比,细胞形态学未出现恶性变化。结论:脐血中存在MSCs,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

人脐血间充质干细胞的分离培养与向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 探讨来源于人脐血的间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化成神经元样细胞的可行性，以及在体外分离、纯化和扩增的条件。方法 无菌条件下收集正常足月剖腹产胎儿的脐带血，经肝素抗凝，用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞，以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化，获得贴壁细胞，取扩增第三代后的MSCs向神经元样细胞诱导分化。用免疫荧光标记方法检测神经元特异性标记物。结果 来源于脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后，可产生贴壁细胞，主要表现为破骨样和间充质样细胞；传3代后，这些细胞可得到纯化、扩增；免疫组化标记显示经诱导后的MSCs表达神经丝蛋白(NF)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论 源于脐血的MSCs在体外可以培养、扩增，并向神经元样细胞分化，可作为神经干细胞的来源而用于实验研究和临床。     

人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定

目的 建立体外分离和培养人脐血间充质干细胞的方法,并探讨脐血间充质干细胞是否具有与骨髓间充质干细胞相一致的免疫表型.方法 无菌条件下采集正常产胎儿脐血,用相对密度为1.077的淋巴细胞分离液分离脐血间充质干细胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells,UCB-MSCs),采用贴壁培养法获得MSCs,体外培养并对其增殖进行观察.用流式细胞仪检测细胞周期状态和白细胞表面抗原.结果 来源于脐血的MSCs在含有15%胎牛血清和低糖DMEM培养基中可以贴壁,并表现为间充质样细胞;传3代后,此类细胞可以纯化、扩增;其细胞倍增时间为60h左右.流式细胞分析细胞周期显示大部分细胞(85%)处于G0/G1期;此类细胞稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD54、CD105,但不表达造血细胞系的表面标记CD34、CD45.结论 脐血中可培养出非造血干细胞,其白细胞表面抗原表达与骨髓间充质干细胞有较强的一致性.     

人脐带血间充质干细胞的体外培养及影响因素

目的:建立人脐带血的间充质干细胞(MSCs)体外培养、扩增的方法。方法:无菌条件下取正常足月的脐带血,分离单个核细胞,以含5%胎牛血清的低糖DMEM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞,测定MSCs的生长曲线,用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果:脐血中的单个核细胞在适当的条件下分离、培养,获得的MSCs均一稳定地表达相关的抗原标记CD29、CD44、CD105,但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。结论:脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够作为间充质干细胞的一种有效来源。     

脐血单个核细胞体外定向分化为神经干细胞及其致瘤性的实验研究

目的：探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞标志物mRNA的表达，并观察其致瘤性。方法：使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞，用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞（MSCs）。观察培养过程中脐血MSCs形态的变化，通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达。使用NGF和RA联合诱导后，用RT—PCR方法鉴定诱导前后神经干细胞（NSCs）标志物巢蛋白（Nestin）及Musashi-1蛋白mRNA的表达；收集培养后7d的MSCs，接种于裸鼠皮下，观察是否有增生物的出现，并观察细胞组织形态学变化。结果：脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形，诱导后可分化为神经元样细胞。流式细胞仪检测该细胞不表达CD34，CDlla和CDllb，强表达CD29，符合MSCs特征。诱导后，NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强（P〈0．05），48h达高峰，然后逐渐减弱；细胞接种后12周．在裸鼠皮下不能形成肿瘤，与对照组相比，细胞形态学未出现恶性变化。结论：脐血中存在MSCs，分离后可以体外扩增．诱导后分化为神经元样细胞，并表达NSCs表面标志。在裸鼠体内不具有成瘤性。脐血能够成为NSCs的新来源。     

人脐血间充质干细胞鉴定及用5-氮胞苷诱导后的生物学特性研究

目的探讨脐血间充质干细胞经体外扩增纯化表面CD标志的鉴定及在体外定向分化成心肌样细胞的诱导剂5一氮胞苷（5-aza）作用后的生物学特性。方珐健康妊娠产妇分娩的胎儿脐带血,分离单个核细胞进行培养、传代,取第3代以后细胞用流式细胞仪直接标记分析CD34、CD44、CD90细胞表面标志。10μmmol／L5-aza诱导4周后,进行透视电镜观察,并检测细胞肌球蛋白重链基因的表达。结果体外纯化扩增后的脐血间充质干细胞含有与骨髓来源的间充质干细胞相同的细胞表面标志,第3代以后细胞纯度较高,经5-aza体外诱导培养可形成心肌样细胞。结论脐血间充质干细胞经体外纯化扩增,第3代以后的细胞纯度较高,在体外经5-aza诱导定向分化为心肌样细胞后,其基本的生物学特性未发生改变。     

人脐血单个核细胞的体外培养观察

目的对脐血间充质干细胞进行体外培养，以进一步阐明其生物学特性，为今后的基础研究和临床应用打好基础。方法采用DMEM培养基培养脐血单个核细胞，流式细胞仪检测细胞表面标志。结果脐血单个核细胞在体外培养24d时，细胞表面CD11b、CD34、CD44和CD45表达阴性，GFAP和nestin表达也为阴性。结论培养所得的单个核细胞区别于脐血中的造血干细胞。     

人脐血间充质干细胞分离培养及向成骨细胞分化的研究

目的拟建立一套较为简便、有效和实用的人脐血间充质干细胞(MSCs)体外分离培养体系,探讨其向成骨细胞分化的可行性。方法由人脐静脉血获得MSCs,纯化培养后用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的培养液诱导,通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色检测诱导后细胞。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维细胞样的细胞形态。诱导培养的细胞碱性磷酸酶染色呈阳性。结论人脐血MSCs经合理的体外诱导培养后,可以分化为成骨细胞。     

体外诱导人脐带血间充质干细胞为软骨细胞的初步研究

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)体外诱导人脐带血间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化的可能性。方法由人脐静脉获得MSCs,纯化培养后用含100ng/ml IGF-1的培养基诱导,扫描电镜鉴定诱导后细胞。结果来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现形态学上可见间充质样的细胞,间充质样细胞为类似成纤维样的细胞形态。IGF-1诱导16天后,MSCs开始呈现软骨细胞特点。结论人脐带血MSCs可在体外经IGF-1诱导为软骨细胞。     

人脐血间充质干细胞向肝细胞样细胞的分化

目的 从脐血中获得间充质干细胞（MSC），探索体外诱导MSC向肝细胞分化的实验条件。方法 无菌采血，分离脐血单个核细胞。以贴壁培养法获得MSC，采用流式细胞术检测细胞表面标志。分别用联合诱导法(联合诱导组)以及阶段诱导法(阶段诱导组)诱导MSC向肝细胞分化。采用RT-PCR检测ALB、AFP及CK19mRNA的表达情况。结果 MSC呈长梭形，第三代（P4）后增殖较快。流式细胞术检测表明：CD29及CD44阳性，而CD34及CD45阴性。诱导6周后，联合诱导组无变化，而阶段诱导组细胞由长梭型变为不规则型，并检测到AFP mRNA的阳性表达,而未见ALB、CK19 mRNA的表达。继续诱导2周，检测到AFP、ALB、CK19 mRNA的表达。结论 脐血中的MSC对高密度、高血清的依赖性高。在体外，阶段诱导方法可将MSC诱导成肝细胞。     

脐血CD34＋细胞向内皮细胞诱导分化的体外研究

目的：探讨从脐血中分离CD34＋细胞,并诱导、鉴定其分化为内皮细胞的方法。方法：羟乙基淀粉沉降、密度梯度离心两步法制备脐血单个核细胞,免疫磁珠分选法（MACS）获得CD34＋细胞,在含有细胞因子的M199培养基中诱导。观察细胞形态变化,摄取Dit标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil—AcLDL）的情况,流式鉴定细胞表面标志。结果：分选CD34＋细胞纯度在91％以上,培养3d有明显集落形成及部分细胞贴壁,14d贴壁细胞呈条索状,逐渐增多后呈铺路石样改变。流式检测贴壁细胞表达血管内皮细胞特异性标志物CD144、vWF、CD31、CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达,与成熟的脐静脉内皮细胞表达率相近。免疫荧光发现贴壁细胞呈现红色荧光,提示细胞摄取Dil—AcLDL,证明CD34＋细胞分化为有功能的内皮细胞。结论：脐血中存在CD34＋细胞且用两步法和MACS可获得高纯度CD34＋细胞,在特定条件下可分化为内皮细胞。     

脐带血间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的分离培养脐带血间充质干细胞并检测其生物学特性。方法在无菌条件下用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,接种含10％胎牛血清的DMEM培养基中。单个核细胞行贴壁培养后,进行细胞形态学观察,绘制细胞生长曲线,分析细胞周期,检测细胞表面抗原。结果采用Percoll（1．073g／mL）分离的脐血间充质干细胞大小较为均匀,梭形或星形的成纤维细胞样细胞。细胞生长曲线测定表明接后第5天细胞进入指数增生期,至第9天后数量减少;流式细胞检测表明50％～70％细胞为CD29和CD45阳性。结论体外分离培养脐血间充质干细胞生长稳定,可作为组织工程的种子细胞。     

脐带源性和脐血源性间充质干细胞分离培养方法的比较

目的建立分离培养人脐带间充质干细胞（UCMSCs）和脐带血间充质干细胞（UCBMSCs）的方法,并比较其效果。方法无菌条件下采集健康足月新生儿脐带及脐血各30份,分别通过原代贴壁培养法、酶消化法培养UCMSCs,及淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步分离法获得脐血中单个核细胞培养UCBMSCs。应用含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基,比较UCMSCs和UCBMSCs分离培养的效果与生长形态。流式细胞术检测其表面标志及诱导分化鉴定其分化能力。结果UCMSCs原代贴壁培养法8d左右可见成纤维样细胞从组织块边缘爬出且成簇生长,酶消化法培养UCMSCs5d左右均匀生长;UCBMSCs分离培养用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法得到的细胞数量较淋巴细胞分离法明显增多。两种来源MSCs培养方法相比较,UCMSCs原代培养的时间短,培养成功率明显增高。流式细胞仪检测两种来源的MSCs具有MSCs表面标志特征。定向诱导分化结果表明MSCs具有被诱导为成骨细胞、脂肪细胞的分化能力。结论人脐带来源间充质干细胞原代培养周期短,培养效率更高;脐血间充质干细胞的分离方法中羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离两步法效率更高。