携带ePNP基因的减毒伤寒沙门菌的构建及目的基因在胰腺癌细胞中的表达

目的构建含有pEGFP-C1-PNP质粒的减毒鼠伤寒沙门菌SL3261菌株,检测其在胰腺癌细胞BxPc-3中的表达。方法 PCR扩增得到PNP基因,构建真核表达载体pEGFP-C1-PNP,并进行酶切、PCR和测序鉴定。利用电转化法将重组质粒转入减毒鼠伤寒沙门菌SL3261,进行形态学和表面抗原稳定性检测。含质粒SL3261菌株与BxPc-3细胞体外共培养,利用荧光显微镜观察和RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达和PNP基因的转录。结果目的基因正确连接pEGFP-C1中,并成功转入减毒鼠伤寒沙门菌,感染细胞亦检测到目的基因的表达。结论成功构建了能携带ePNP基因真核表达质粒的SL3261菌株,且该基因能在胰腺癌细胞中正确表达。     

携带幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗的构建

目的 构建含幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(ureB)基因重组减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗。方法 抽提Hp标准菌株CCUG17874基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)技术从基因组DNA扩增ureB基因,克隆入pucmT载体,检测ureB基因序列,经过酶切、连接反应将其克隆入真核表达载体pIRES,转入感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,通过PCR和酶切反应进行鉴定。重组载体pIRES-ureB转入减毒鼠伤寒沙门菌LB5000,抽提质粒,再次转入SL7207,反复传代,鉴定重组核酸疫苗菌的稳定性。通过脂质体法将构建好的重组载体pIRES-ureB转染COS-7细胞,SDS-PAGE Western印迹法检测pIRES-ureB表达蛋白的免疫原性。结果 扩增出长约1700bp的ureB基因,测序结果表明扩增出的ureB基因与基因库Hp ureB序列一致,PCR和酶切鉴定结果证实ureB基因克隆人真核表达载体pIRES,并成功构建了Hp ureB基因的减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,重组核酸疫苗稳定,并且Westem印迹法检测到特异性的蛋白条带。结论 构建了具有免疫反应性的Hp UreB减毒鼠伤寒沙门菌核酸疫苗,为进一步探索其体内的免疫作用奠定了基础。     

小鼠单链白细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的:构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗(Bacille calmette-guerin.BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法:以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果:电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带.结论:成功构建含pBM12的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

人颗粒溶素活性肽重组卡介苗的构建与表达

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)活性肽的重组卡介苗(BCG),并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.方法 以分子生物学方法构建携带GLS活性肽基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBMS,以电转化方式将pBMS质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT-PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力.结果 采用电转化方式可将pBMS导入BCG,抽提质粒鉴定出与GLS基因相符的目的 条带.以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96 h后用RT-PCR法可扩增出相应的基因条带.结论 成功构建含pBMS的重组BCG.该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因.     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白DNA疫苗的构建及其免疫保护作用

目的:构建携带幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白(Hp neutrophil-activating protein,Hp-NAP)基因(napA)活减毒鼠伤寒沙门菌重组DNA疫苗,初步观察其对慢性Hp感染的免疫保护作用.方法:应用基因工程技术扩增全长napA,测序并经同源性分析后,将其亚克隆入真核表达载体pIRES,鉴定正确后将重组质粒转化活减毒鼠伤寒沙门菌构建Hp-NAP口服DNA疫苗.口服Hp-SS1建立SS1长期感染小鼠模型,30周后随机均分为3组,每组各5只.治疗组予109cfu/0.4 ml疫苗菌灌胃,1次/周×3周;2个对照组分别予等体积生理盐水或空白质粒.末次免疫4周后行快速尿素酶检测,ELISA测定血清抗体效价.结果:重组真核表达质粒pIRES-napA成功转化活减毒鼠伤寒沙门菌SL7207;所克隆napA与GenBank中SS1-na-pA核苷酸和蛋白质的同源性均＞98%.免疫后4周治疗组75%(3/4)小鼠快速尿素酶检测阴性,对照组均阳性,差异显著(P＜0.05);治疗组血清抗Hp-NAP抗体效价明显升高.结论:成功构建了具有较好免疫保护作用的Hp-NAP口服重组DNA疫苗,为进一步研制多价抗Hp核酸疫苗奠定了基础.     

人CTLA-4Ig融合基因减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体的构建及表达

目的构建能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,探讨其在哺乳动物细胞中的表达并对表达产物进行鉴定。方法用touchdown PCR法扩增CTLA-4 Ig融合基因,将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig,用电穿孔仪转入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207。将表达质粒转染COS-7细胞,SDS-PAGE、W estern b lot检测转染细胞裂解上清中目的蛋白的表达。结果酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功。在pcDNA3.1( )-CTLA-4 Ig质粒转染后48 h细胞裂解上清中,检测到CTLA-4 Ig融合蛋白的表达,该蛋白能与抗人CTLA-4单抗特异结合。结论成功构建了能稳定表达人CTLA4 Ig融合基因的减毒鼠伤寒沙门菌真核表达载体,并在哺乳动物细胞中成功表达有生物学活性的重组人CTLA-4 Ig蛋白。     

小鼠单链自细胞介素-12重组卡介苗的构建与表达

目的：构建携带小鼠白细胞介素-12基因的重组卡介苗（Bacille calmette—guerin,BCG）,并鉴定该重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。方法：以分子生物学方法构建携带小鼠IL-12基因和分支杆菌复制子OriM的真核穿梭共表达质粒pBM12,以电转化的方式将pBM12质粒转入BCG构建重组BCG,抽提质粒进行PCR鉴定重组菌;将重组菌感染巨噬细胞,通过RT—PCR了解重组菌向真核细胞递呈质粒的能力。结果：电转化方式可将pBM12导入BCG,抽提质粒鉴定出与mIL-12基因相符的目的条带。以该重组BCG感染小鼠巨噬细胞,96h后用RT—PCR法也扩增出1632bp左右的基因条带。结论：成功构建含pBM12的重组BCG。该重组BCG能向小鼠巨噬细胞递呈携带基因。     

荷瘤小鼠口服重组减毒鼠伤寒沙门菌后瘤体内富集效果的观察

目的观察重组减毒鼠伤寒沙门菌作为基因载体在人涎腺腺样囊性癌裸鼠移植瘤中的富集情况和对外源基因的呈递能力。方法以绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,以减毒鼠伤寒沙门菌SL7207为转基因载体,分别构建原核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP和真核启动GFP表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pEG-FP-N1。原核菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代,观察GFP基因表达的稳定性;同时,对荷人涎腺腺样囊性癌皮下移植瘤裸鼠模型口服给予原核菌SL7207-pUC-GFP(0.1mL,1×109cfu/mL),在口服后24h、48h、5d、10d、20d、30d处死荷瘤裸鼠,获取肝、脾及肿瘤组织并制成匀浆液进行重组菌培养及GFP表达检测,观察重组菌在瘤体细胞内富集情况。对荷瘤裸鼠模型口服给予真核菌SL7207-pEGFP-N1,5d后取肝、脾及肿瘤组织进行冰冻组织切片,荧光显微镜下观察GFP的表达,了解重组菌携带外源基因在肿瘤细胞内的表达。结果携带GFP原核表达的重组减毒鼠伤寒沙门菌SL7207-pUC-GFP在体外连续传代10次未见表达减少或缺失。荷瘤裸鼠口服原核表达GFP基因重组菌SL7207-pUC-GFP菌液实验表明,重组菌SL7207-pUC-GFP在肝、脾及肿瘤组织中能长期存活,以肿瘤组织中聚集明显(P<0.05)且维持时间较长。荷瘤裸鼠口服真核表达GFP基因重组菌SL7207-pEGFP-N1菌液实验表明,相对肝脏和脾脏组织,外源基因在肿瘤细胞内表达量最高。结论重组减毒鼠伤寒沙门菌可以在瘤体细胞内富集存活,并且携带的外源基因可以释放到肿瘤细胞内表达,具有作为基因治疗载体的双重优势。     

pCDR1Th表位和CTLA4Ig双基因共表达真核表达载体的构建

目的 构建能稳定表达pCDR1 Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体,探讨其在小鼠体内的表达并对表达产物进行鉴定.方法 用Touchdown PCR法扩增CTLA4Ig基因,同时引入pCDR1 Th表位.将PCR产物连接真核表达载体pcDNA3.1( ),构建pcDNA3.1( )-CTLA41g-pCDR1.将构建表达CTLA4Ig-pCDR1减毒鼠伤寒沙门菌SL7207喂饲BALB/c小鼠,取脾脏进行免疫组化鉴定重组蛋白在动物体内的表达.结果 酶切鉴定和基因序列测定显示重组质粒构建成功.重组蛋白在BALB/c小鼠脾脏免疫细胞胞浆中有阳性表达.结论 成功构建了能稳定表达pCDR1 Th表位和CTLA4Ig融合基因的真核表达载体.     

携带flk-l的减毒沙门疫苗菌抗胶质瘤血管生成的研究

目的观察表达鼠血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,flk-1)的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌对胶质瘤荷瘤小鼠的抗肿瘤血管及肿瘤生长抑制作用。方法构建真核表达载体pcDNA3 1.-flk-l,通过电转化法将pcDNA3 1.-flk-1导入减毒鼠伤寒沙门菌SL7207中,经由胃管饲于C57BL/6J小鼠,对胶质瘤荷瘤小鼠进行免疫预防及治疗。通过观察免疫动物的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管密度,评价重组疫苗菌的抗血管及肿瘤生长抑制作用。分离免疫小鼠的脾细胞,分析重组疫苗菌免疫后小鼠体内的特异性细胞毒性T细胞(CTL)应答。结果重组疫苗菌免疫能够明显减少肿瘤血管密度,延缓胶质瘤的生长,延长小鼠生存期,获得明显的抗肿瘤效果。重组疫苗菌免疫后可诱导小鼠脾淋巴细胞产生针对flk-l的CTL活性。结论表达鼠flk-l的重组减毒鼠伤寒沙门疫苗菌经口服免疫,可打破小鼠对于自身抗原flk-1的免疫耐受,诱导小鼠产生抗flk-1的特异性免疫反应,特异性杀伤肿瘤血管内皮细胞,预防和治疗小鼠胶质瘤。     

miR-210靶基因HBVSP2的鉴定

目的：构建miR-210的过表达载体,利用双荧光蛋白报告基因分析系统验证miR-210的靶基因HBVSP2。方法：构建含有miR-210前体序列的miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210;选取表达绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒 pcDNA3/EGFP,将miR-210在HBVSP2上靶位点的一段特异性序列插入该质粒中,构建EGFP报告载体pcDNA3/EGFP-HBVSP2,并与miR-210ASO或者pcDNA3.1(+)/pri-miR-210及表达红色荧光蛋白质(RFP)的pDsRed2 -N1共同转染HEK293以及HepG2 2215细胞,用荧光分光光度计定量检测转染后提取的蛋白样品的荧光值。结果：共同转染pcDNA3/pri-miR-210 和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2质粒后,EGFP/RFP的表达量明显低于pcDNA3和pcDNA3/ EGFP-HBVSP2共转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。pcDNA3/pri-miR-210和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于pcDNA3和pcDNA3/EGFP-HBVSP2共转染组(P<0.05)。共转染miR-210ASO和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP的表达量高于共转染LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组,差异具有统计学意义(P<0.05)。LacZ和pcDNA3/EGFP-HBVSP2组EGFP/RFP低于LacZ和pcDNA3/EGFP组(P<0.05)。结论：成功构建miR-210的过表达质粒pcDNA3.1(+)/pri-miR-210和含有miR-210靶位点的pcDNA3/ EGFP-HBVSP2,HBVSP2 可能是miR-210的直接靶基因。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定

目的 扩增D型沙眼衣原体ompA基因，构建真核表达重组质粒，为核酸疫苗的研制做准备。方法 用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段，重组入pUCm—T克隆载体。将pUCm—T／ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 从D型ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段，筛选出pUCm—T／ompA；经亚克隆，筛选鉴定出pcDNA3．1( )／ompA重组质粒。结论 成功地构建了pUCm—T／ompA重组质粒和pcLDNA3．1( )／ompA重组质粒，为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础。     

携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建及其SK-N-SH细胞表达

目的构建携带人alpha-突触核蛋白真核重组质粒,检测其在人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞中的表达及对细胞存活率的影响。方法 PCR扩增alpha-突触核蛋白基因,产物纯化后与pcDNA3.1(+)载体进行连接反应,构建pcDNA3.1(+)/alpha-突触核蛋白真核重组质粒。Lipofectamine法转染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞,RT-PCR方法检测SK-N-SH细胞中alpha-突触核蛋白mRNA的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测其对细胞存活率的影响。结果酶切鉴定及基因测序证明人alpha-突触核蛋白基因已被完整、正确地插入到pcDNA3.1(+)载体中。RT-PCR结果显示该表达载体转染SK-N-SH细胞后,细胞内alpha-突触核蛋白mRNA的表达水平明显增高,MTT方法检测结果显示该表达载体转染并未引起细胞存活率的改变。结论 alpha-突触核蛋白真核重组质粒构建成功,并可在SK-N-SH细胞内表达,且对细胞的存活率不产生任何影响,从而为进一步研究alpha-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用奠定了基础。     

RBM5 基因表达载体构建、稳定转染A549 细胞系的建立及功能的初步研究

目的：通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系, 初步研究RBM5基因过表达对A549 细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表 达的影响。方法：应用分段克隆法构建pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pcDNA3.1(+)/ RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别 检测经pcDNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pcDNA3.1(+)/RBM5-A549]及pcDNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞 [pcDNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pcDNA3.1(+)/RBM5-A549和pcDNA3.1(+)-A549细胞中剪 接相关因子DHX15的表达情况。结果：成功构建出pcDNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过 表达阳性细胞株;pcDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均 P<0.01);cDNA3.1(+)/RBM5-A549较pcDNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论：成功构建重组质粒 pcDNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细 胞周期,并使DHX15表达上调。     

HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的克隆人类免疫缺陷病毒Ⅰ型B亚型包膜糖蛋白gp120基因,构建真核表达载体,并在真核细胞中表达,进一步为制备自行设计的以λ噬菌体作为载体的HIV核酸疫苗奠定基础。方法以克隆好的HIV-1B亚型U26942全基因质粒DNA作为模板,根据Genbank中gp120基因的核苷酸序列设计引物,并在引物的5'端分别引入BamHⅠ及XhoⅠ酶切位点,特异性地扩增gp120基因。TA克隆后经双酶切、测序等鉴定重组质粒,再经双酶切、连接构建含gp120编码基因的真核表达载体,并进行酶切鉴定分析pcDNA3.1( )/gp120。在脂质体介导下转染HepG2细胞,经G418压力筛选建立稳定转染gp120基因的细胞系,用RT-PCR及Westernboltting检测其在HepG2细胞中的表达。结果重组质粒经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切成5.4kb与1.44kb的片断,表明表达载体pcDNA3.1( )中插入了gp120基因片断,测序结果表明编码框正确。RT-PCR及Westernblotting证实稳定转染gp120基因的HepG2细胞系中有该基因的表达。结论成功构建了HIV-1B亚型包膜糖蛋白gp120基因的真核表达载体pcDNA3.1( )/gp120,并在HepG2细胞中获得稳定表达。     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG，并检测其在体外的表达，为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增，将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-），测定序列后，用脂质体包裹转染C2C12细胞，采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确，该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

人宫颈癌Ca Ski 细胞 IL-24基因的克隆鉴定与真核表达

目的:克隆人IL-24基因并构建真核表达载体,转染Ca Ski细胞进行真核表达.方法:利用RT-PCR技术扩增出Ca Ski细胞中的IL-24基因.将IL-24基因克隆人pcDN3.1( )中,构建真核表达质粒pcDN3.1( )-hIL-24的表达.结果:PCR及测字结果均证实在功克隆了人IL-24,该质粒被转染人Ca Ski细胞中能表达出hIL-24蛋白.结论:成功构建了hIL-24基因的真核表达载体.