重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响

目的构建表达SH2-DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,观察其对K562细胞增殖的抑制作用。方法重叠PCR扩增SH2-DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建成穿梭质粒pAdT-SD-EGFP并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经Pme I酶切后转化pAd5F35-GFP的BJ5183感受态,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAd5F35-SD-EGFP及其突变体,Pac I酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP经PCR和western blot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞,通过MTT和流式周期检测实验观察Ad5F35-SD-EGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD-EGFP和pAd5F35-SD-EGFP构建成功;PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP包装扩增成功,滴度可达1.4×1012 pfu/ml。转染K562细胞后,Western blot可检测到目的蛋白的表达,MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制作用。结论成功构建并鉴定了携带SH2-DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP,其对BCR-ABL阳性K562细胞的增殖有明显的抑制作用。     

hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为后续基因转染和动物实验提供实验基础。方法通过RT-PCR从A549细胞中分别获得hBcl-2和hVEGF165基因片段,并克隆到pMD-19T载体。将目的基因hBcl-2、IRES元件和hVEGF165依次定向克隆到腺病毒穿梭载体质粒pAd-Track-CMV上。线性化重组穿梭质粒后通过电穿孔转化含有腺病毒骨架质粒pAd-easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。脂质体转染线性化的重组腺病毒载体质粒于HEK293细胞以包装制备重组腺病毒。重组腺病毒经PCR鉴定之后进一步扩增、纯化。通过荧光计数确定病毒感染滴度。结果克隆的hBcl-2和hVEGF165基因测序正确,酶切重组穿梭载体质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物,重组腺病毒载体质粒转染HEK293细胞3 d后观察到GFP的表达,重组腺病毒的PCR得到hBcl-2和hVEGF165基因的PCR产物,滴度测定为5×109pfu/mL。结论成功构建制备了高滴度的hBcl-2和hVEGF165双基因共表达的重组腺病毒载体,为联合基因治疗心肌梗死的研究提供实验基础。     

ndrg2基因2种亚型重组腺病毒载体的构建

目的：构建表达N-myc下游调节基因2（ndrg2）2种亚型的重组腺病毒载体,为与ndrg2相关肿瘤的基因治疗奠定基础.方法：采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体.首先将ndrg22种亚型（长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S）利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆入入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-NDRG2L和pENTR2B-NDRG2S,经双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR Clonase^TMⅡ Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应,以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L和pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2S的质粒.表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒（分别命名为Ad-NDRG2L和Ad-NDRG2S）,经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法（TCID50）检测病毒滴度,用Western Blot法检测重组病毒载体是否能正确表达NDRG2蛋白.结果：证实入门克隆pENTR2B-NDRG2L/S和表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L/S经酶切鉴定和PCR鉴定质粒构建正确,转染HEK293A细胞并反复扩增后获得的病毒滴度分别为：Ad-NDRG2L,4.0×10^12空斑形成单位（PFU）/L;Ad-NDRG2S,6.3×1012PFU/L.且这2个病毒能正确表达NDRG2蛋白.结论：成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据.     

腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞的比较

目的比较腺病毒和慢病毒载体感染骨髓间质干细胞（rMSCs）的荧光病毒基因表达的稳定性及持续时间。方法将含有绿色荧光蛋白（GFP）基因的慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,重组包装;将慢病毒和腺病毒载体分别感染rMSCs,培养5周,分别在1、3、5周通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。从GenBank中调出人骨形态发生蛋白2（hBMP2）基因序列,设计带有NheⅠ、AgeⅠ双酶切位点引物。从人肝脏组织中抽提总RNA,再逆转录成cDNA,扩增出hBMP2基因的全长序列。测序验证后克隆到慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上,通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染293T细胞,通过重组而包装成能表达hBMP2基因的有活性的慢病毒。结果两种病毒载体感染后1周,绿色荧光蛋白表达分别是90％和71％,到5周时,慢病毒载体的绿色荧光蛋白表达明显高于腺病毒载体,分别是79％和0．05％。扩增出1．2kb左右的hBMP2全长基因与GeneBank中的hBMP2阅读框架序列完全一致;成功克隆和构建了含hBMP2基因的慢病毒载体pHIV-hBMP2;对慢病毒载体进行了成功包装和分析。结论含hBMP2基因的慢病毒载体可成功构建。慢病毒载体对大鼠骨髓间质干细胞的转染效率明显优于腺病毒载体。     

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

hBMP-2真核表达载体的构建及转染兔骨髓间充质干细胞的表达

目的:构建pcDNA3.1-hBMP2真核表达质粒并检测其在兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的表达.方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人骨肉瘤中扩增出人骨形成蛋白-2(hBMP2)基因片段,构建成pcDNA3.1-hBMP2重组质粒.转染兔骨髓间充质干细胞并通过RT-PCR和免疫组化检测其表达.结果:本实验构建的重组质粒目的基因片段为hBMP2-cDNA.经RT-PCR和免疫组化证实,转染pcDNA3.1-hBMP2后的兔骨髓间充质干细胞内有大量hBMP2 mRNA的转录和蛋白的表达.结论:本实验成功构建hBMP2真核表达质粒并在骨髓间充质干细胞中得到表达,为进一步研究用BMP2基因转染的方法来加速牵张成骨新骨形成奠定了基础.     

人骨形态发生蛋白7重组腺病毒的制备及在骨髓基质干细胞中的表达

目的:构建骨形态发生蛋白7(BMP-7)和绿色荧光蛋白(GFP)融合基因的重组腺病毒载体,并检测其在骨髓基质干细胞(BMSCs)的表达.方法:RT-PCR法获得BMP-7基因.将其克隆至pcDNA3.1/CT-GFP质粒中,PCR扩增hBMP-7/GFP融合基因片段,与线性化pAxCAwt腺病毒载体连接,转染大肠杆菌LE392,筛选重组腺病毒黏粒,大量扩增后与DNA-TPC共转HEK293细胞,获得重组腺病毒Ad.hBMP-7/GFP.用重组病毒液转染兔BMSCs细胞,免疫组化方法检测BMP-7的表达.结果:经过多聚酶链反应及酶切鉴定证明获得了BMP-7重组腺病毒基因组,并包装出重组腺病毒,滴度为4.4×108pfu/ml.荧光显微镜和免疫组织化学证明BMP-7在重组腺病毒转染后的BMSC细胞中得到了表达.结论:成功制备BMP-7重组腺病毒,为骨缺损局部基因治疗研究奠定基础.     

人白细胞介素21基因重组复制缺陷型腺病毒的制备与鉴定

目的 制备表达绿色荧光蛋白的含人白细胞介素21(IL-21)基因的重组复制缺陷型腺病毒,为IL-21基因治疗肿瘤的研究奠定基础.方法 从人外周血淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增IL-21基因片段,PCR产物和pDC316-mCMV-EGFP载体分别经限制性内切酶Notl与HindⅢ双酶切,然后将酶切产物连接、转化,构建pDC316-IL21-EGFP重组质粒.重组质粒经酶切和测序鉴定后,与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3CreF35共转染293细胞,包装产生Ad5F35-IL21-EGFP重组腺病毒,并测定病毒滴度.观察Ad5F35-IL21-EGFP腺病毒转染后食管癌细胞EC-9706的生长曲线和细胞周期的变化.结果 pDC316-IL21-EGFP重组质粒经酶切和测序证实,IL-21基因片段正确插入pDC316-mCMV-EGFP栽体中且与GenBank中,IL-21基因序列一致.AdSF35-IL21-EGFP重组腺病毒栽体在293细胞中包装成功.获得成熟的病毒颗粒,经鉴定有IL-21基因和绿色荧光蛋白的表达.测得Ad5F35-IL-21-EGFP病毒颗粒滴度为9×1011VP/ml,感染性滴度为5×1010IU/ml.AdSF35-IL21-EGFP转染后,EC-9706细胞的生长缓慢(P＜0.05),G1期细胞增加,而G2期和S期细胞减少.结论 成功制备了表达绿色荧光蛋白的人IL-21基因的重组腺病毒,且病毒滴度较高.腺病毒介导的外源性IL-21基因可有效转染EC-9706细胞,并对其生长有抑制作用.     

骨形态发生蛋白-4基因重组腺病毒载体的构建

目的:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建携带人骨形态发生蛋白-4基因的重组腺病毒载体(Ad.BMP4)。方法:根据GenBank获得BMP4的基因序列合成引物,经PCR扩增获得长度为1230bp的BMP4基因片断,经酶切、测序鉴定后,与腺病毒穿梭质粒pSuCMV连接,随后与5'缺陷型腺病毒右臂的质粒pBGHloxPΔE1E3通过脂质体Lipofectamine2000共转染至293细胞,获得重组腺病毒Ad.BMP4,并予以扩增、纯化、鉴定。结果:经酶切电泳和测序证明获得的BMP4基因片断序列、大小和方向正确,目的基因插入的位置、方向正确,经重组、扩增和纯化后获得病毒滴度为2.9×109pfu/ml的重组腺病毒Ad.BMP4,以PCR扩增和测序的方法证实了所构建病毒含有目的基因的片断,安全性检测证明所构建的腺病毒无野生性腺病毒的存在。结论:通过Cre/LoxP位点特异性重组系统构建了腺病毒Ad.BMP4。采用的腺病毒载体点特异性重组的方法极大地提高了包装成功率,且包装成功的病毒颗粒均为含有目的基因的重组病毒,从而保证了重组过程的快速和高效。     

hBMP2转基因载体的构建及其在兔骨髓基质细胞中的表达

腹泻是离乳婴猴常见病,死亡率极高的病。作者多年的统计结果表明,死亡婴猴中58．3％死于腹泻。过去腹泻早期也使用过一些药物进行治疗, 但效果不太理想。最近,作者用胃肠粘膜保护剂联合思密达,口服补液盐辅助治疗婴猴腹泻,取得良好效果。 1 材料与方法 1．1 动物的选择选取离乳后3-60 d(4月龄离乳)的腹泻婴猴作试验观察,发病时间不超过24 h。全部婴猴半屏     

脂质体介导下重组pcDNA3-hBMP3转染兔关节软骨细胞的条件

目的　探讨基因转移效率与 pc DNA3- h BMP3质粒及阳离子脂质体的浓度、转染时机以及细胞的种殖密度等因素的关系 ,以寻求最佳的基因转染条件 .方法　细胞密度按 2× 10 4· cm- 2 接种后 ,对细胞接种后即时、孵化 2 ,5和 7d进行转染效率研究 ;G418浓度每 m L DMEM分别含有 2 0 0 ,30 0 ,40 0 ,5 0 0和 6 0 0μg,探讨 G418对软骨细胞的杀伤作用 ;选择不同细胞接种密度、不同脂质体浓度和 pc DNA3- BMP3浓度 ,在细胞对数生长期且细胞融合至 70 %～ 80 %时开始做转染 ,各组软骨细胞爬片的原位杂交结果通过计算机图像分析 ,以其灰度值判定基因转染的效率 .结果　最佳期的转染时机为软骨细胞接种后在孵箱内放置 2 d转染 ,即在软骨细胞对数生长期内做转染 .G418对软骨细胞的最佳筛选浓度为 40 0 mg· L- 1 .最佳的细胞种植密度、pc DNA3- BMP3浓度和脂质体的量应分别为 2× 10 4· cm- 2 ,5 μL 和 10 μL.结论　通过本研究探索出脂质体介导下 pc DNA 3- BMP3转染兔关节软骨细胞的最佳条件 .     

CHADS_2/CHA_2 DS_2-VAS_C评分的应用

临床上CHADS2评分和CHA2DS2-VASC评分主要用来对非瓣膜性心房颤动(房颤)血栓栓塞的风险进行评估。由于CHA2DS2-VASC评分系统更为全面,并能筛选出不需要抗凝治疗的"真正的低危患者",因此现多应用此评分系统。然而,两种评分系统所包含的危险因素同样适用于其他心血管疾病,两者也可以被用来对房颤风险、左心房功能进行评估,同时也可对非房颤患者进行预后评估。     

过氧化氢对人肝癌细胞株HepG2增殖的促进作用

目的:探讨低剂量过氧化氢(H2O2)对人肝癌细胞株HepG2的促增殖作用及该作用与NF-κB和细胞周期的关系. 方法: 不同剂量H2O2直接作用于培养的HepG2细胞;20 μmol/L NF-κB抑制剂(PDTC)预处理细胞2 h, 50 μmol/L的H2O2作用HepG2细胞;50 μmol/L H2O2分别作用于G1, G2/M, S期细胞,MTT法测定细胞增殖活性. 结果: 50 μmol/L的H2O2具有明显的促进HepG2细胞生长的作用,此作用可以被PDTC抑制;50 μmol/L的H2O2可以明显的促进G1期HepG2细胞生长. 结论: 低剂量H2O2可诱导HepG2细胞增殖,该过程可能包含依赖NF-κB的信号途径的参与;H2O2诱导HepG2细胞增殖在细胞周期的不同时相效应敏感性不同,主要诱导G1期细胞增殖.     

评价房颤CHADS2评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值

目的：探讨房颤评分系统CHADS2(欧洲)评分及其衍生评分对冠心病及其严重程度的预测价值。方法纳入2013年1月1日-2013年12月1日就诊于本院心血管内科怀疑冠心病并行冠状动脉造影检查的连续病例429例,根据其造影结果分为对照组(n=51)及冠心病组(n=378)。根据患者的临床资料计算其CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分,根据其冠状动脉造影结果计算Gensini积分评价其病变严重程度,并对3种评分的冠心病预测能力进行评价。结果 CHADS2、CHA2DS2-VASc和CHA2DS2-VASc-HSF评分与病变支数(r=0.317,P＜0.01;r=0.332,P＜0.01;r=0.330,P＜0.01)及Gensini积分均有一定相关性(r=0.240,P＜0.01;r=0.274,P＜0.01;r=0.295,P＜0.01)。截断点分析显示, CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病的预测价值最高,其灵敏度、特异度、曲线下面积分别为0.860、0.804、0.832(95%CI：0.766~0.898)。结论 CHADS2及其衍生评分对冠心病有一定的预测价值,尤其是CHA2DS2-VASc-HSF评分≥3对冠心病有较高的预测价值。     

抗人胸腺细胞单克隆抗体2G_2B_2和2G_2C_2的制备及特性鉴定

用杂交瘤技术制备２株单克隆抗体（单抗）２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２。经研究发现,它们主要与胸腺细胞、脐血及ＰＨＡ激活的外周血单个核细胞等反应;免疫组化显示其主要作用于皮质胸腺细胞;与造血系统中分化早期的瘤细胞、骨髓瘤细胞等反应阳性率较高。生物学特性鉴定结果提示,单抗均属免疫球蛋白ＩｇＧ１亚类,腹水效价达１：１２８０００,所识别抗原分子量为４５／４６ＫＤａ,无抗原调变作用。故２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是类似ＯＫＴ１０的抗ＣＤ３８单抗,但竞争抑制结果表明三者分别作用于不同的抗原决定簇,即２Ｇ２Ｂ２、２Ｇ２Ｃ２是两个抗ＣＤ３８新单抗。     

2－（2－甲氧基苯氧）乙胺的合成

２－（２－甲氧基苯氧）乙胺Ⅰ是合成某些抗高血压药物的重要中间体，本研究探索二种途径制备。一是以２－甲氧基苯酚为起始原料，经相应的苯氧乙酸、苯氧乙酰胺，再用ＺｎＣｌ２－ＫＢＨ４－ＴＨＦ－Ｃ６Ｈ５－ＣＨ３体系还原，得目的物，并将Ⅰ转变成盐酸盐Ⅱ。二是通过Ｇａｂｒｉｅｌ反应制备目的物。结果表明第一种途径总收率（５８．１％）高于其他路线，并有原料易得、操作简便的优点     

pD_2和pA_2的测定

本文采用大鼠肛尾肌分别介绍测定苯肾上腺素ｐＤ＿２和其拮抗剂哌唑嗪ｐＡ＿２的方法。同时讨论了ｐＤ＿２和ｐＡ＿２的意义和推导过程。     

Dab2/DOC-2基因的研究进展

Dab2/DOC-2是具有信号转导功能的磷蛋白,在丝裂原信号转导途径中起作用,通过蛋白质的相互作用和蛋白磷酸化发挥作用,参与控制细胞生长的信号通路而发挥生长抑制效应,Dab2/DOC-2又作为胞质衔接蛋白,参与细胞内蛋白运输。在肿瘤中纯合子基因缺失时被激活,是抑癌基因的候选成员。其在多种肿瘤中低或失表达,如卵巢癌,乳腺癌,绒毛膜癌和前列腺癌等,重新表达能抑制肿瘤的生长。Dab2也在胚胎的发生过程中发挥重要的作用。     

KIR2DS2基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA(short hairin RNA,shRNA)的RNAi慢病毒载体.方法针对已经筛选确定的KIR2DS2基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pSicoR-GFP载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV-shKIR2DS2慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定.用LV-shKIR2DS2及Packaging system质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果PCR和测序证实,成功构建KIR2DS2shRNA的慢病毒载体LV-shKIR2DS2.293T细胞测定病毒滴度为6×108TU/ml.结论成功构建携带KIR2DS2基因短发夹状干扰RNA的RNAi慢病毒载体.