人信号传导及转录激活因子shRNA载体的构建与鉴定

目的：构建针对人信号传导及转录激活因子1（STAT1）基因的shRNA表达载体,检测其对STAT1基因的沉默效果。方法设计针对STAT1的shRNA序列,克隆到pGPU6质粒载体,并进行测序、转染和鉴定。结果 DNA测序显示成功构建了4个shRNA表达载体。shRNA能有效抑制STAT1基因在人宫颈癌细胞株TZM- bl细胞中的表达,抑制率为63%。结论成功构建了针对人STAT1基因的shRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo- shRNA STAT1。     

针对乙酰肝素酶基因的短发夹RNA干扰载体的构建

目的 构建对人乙酰肝素酶(hpa)基因有特异性抑制作用的短发夹RNA(ahRNA)表达载体.方法 根据GenBank数据库提供的hpa基因核苷酸序列,按照shRNA设计原则设计5对特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中,酶切鉴定和测序验证阳性克隆.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒...     

ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立

目的构建针对膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)的shRNA(small hairpin RNA),稳定转染小鼠低淋巴道转移力肝癌Hca-P细胞,筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株,为后续研究奠定基础。方法合成2条ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建pGPU6/GFP/Neo-shR-NA-ANXA11表达载体并转染Hca-P细胞,通过G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,Western blot检测Hca-P细胞ANXA11蛋白表达,并与空载体转染及对照组比较。结果成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11重组表达质粒,并获得pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-Hca-P单克隆细胞株;shRNA-1重组质粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平对ANXA11抑制率分别为80.2%和77.7%,P<0.01。结论通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了ANXA11表达稳定下调的Hca-P细胞株,得到了其单克隆细胞株,为进一步研究ANXA11在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用及机制打下了基础。     

RNA干扰CA916798基因真核表达载体的构建与鉴定

目的 构建CA916798基因RNA干扰(RNAi)的真核细胞表达载体.方法 以CA916798为靶基因,以pGenSil-l质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的CA916798基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计2条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-l中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析.用脂质体2 000将重组质粒转染A549/CDDP细胞并用G418筛选,MTT法测定药物敏感性并绘制细胞增殖曲线.结果 构建针对CA916798的pRNAi-CA916798shRNA,经限制性内切酶酶切、PCR和DNA测序证实与设计完全一致;在荧光显微镜下观察到A549/CDDP细胞表达绿色荧光蛋白(GFP)证实重组质粒已转染入细胞并用G418剔除了未转染质粒的细胞,1.0μg/ml顺铂作用后pRNAi-CA916798shRNA转染组细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01).结论 成功构建CA916798基因的shRNA表达载体,并筛选出转染了CA916798shRNA的A549/CDDP细胞.     

新趋化因子VCC-1小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建对VCC-1基因有特异性抑制作用的小干扰RNA(siRNA)表达载体.方法 根据VCC-1 mRNA序列,按照siRNA设计原则设计4条特异性的寡核苷酸序列及阴性对照,分别克隆到pGPU6/GFP/Neo载体中.酶切鉴定和测序验证阳性克隆.用脂质体转染SMMC7721细胞,以RT-PCR分析其对VCC-1 mRNA表达的影响.结果 经酶切、测序鉴定均证实重组质粒构建成功.pGPU6/GFP/Neo-siRNA、B、C、D载体均能抑制SMMC7721细胞VCC-1基因mRNA的表达,其中重组质粒C抑制作用最强.结论 成功构建了靶向人VCC-1的小干扰RNA表达载体,为进一步研究VCC-1的功能奠定了基础.     

Hath1基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的表达

目的：构建携带Hath1基因的真核表达载体并转染神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）,观察其在SH-SY5Y细胞中的表达。方法： 从人全血中提取DNA,克隆Hath1基因,同时扩增色荧光蛋白（GFP）gfp基因;利用引物GFP-R和Hath1-F扩增融合基因gfp-Hath1,克隆至pMD18-T中;经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性内切酶酶切,构建重组表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1;转染SH-SY5Y细胞。结果：PCR扩增,融合基因gfp-Hath1扩增条带大小为2 023 bp,表明成功扩增gfp-Hath1融合基因。经双酶切鉴定,成功构建真核表达质粒pCDNA3.1(+)::gfp-Hath1。采用间接免疫荧光技术在荧光显微镜下观察到5H-SY5Y细胞中有GFP表达。结论：本研究成功地使Hath1基因在SH-SY5Y细胞中得到表达,为转染耳蜗组织的实验及探索治疗耳聋新方法奠定基础。     

一种方便酶切鉴定的shRNA表达载体改建方法

目的 建立一种用单限制性内切酶酶切来快速筛选重组小发夹RNA(shRNA)表达载体的方法.方法 制备包含单一限制性内切酶Cta Ⅰ识别序列的双链DNA插入片段(Cla Ⅰ位点两侧碱基序列不互补).与BamH Ⅰ和Hind Ⅲ线性化的shRNA表达载体pSilencer-4.1(不含Cla Ⅰ识别序列)构建载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ.用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,将酶切产物与表达绿色荧光蛋白(GFP)shRNA的DNA模板(不含Cla Ⅰ识别序列)做连接反应.构建GFP shRNA表达质粒.提取阳性克隆质粒DNA,行Cla Ⅰ单酶切鉴定,对未被Cla Ⅰ线性化的质粒行DNA测序鉴定.结果 DNA测序表明正确构建了shRNA表达载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,以pSilencer-4.1-Cla Ⅰ为载体构建的GFPshRNA候选重组子中,不能被Cla Ⅰ线性化的均为GFP shRNA表达质粒.结论 构建了可用于制备shRNA表达质粒的通用载体pSilencer-4.1-Cla Ⅰ,所引入的单一的Cla Ⅰ识别位点可以用来快速地筛选重组shRNA表达质粒.     

PDLIM5 shRNA质粒构建及其稳定转染SH-SY5Y细胞株的建立

目的构建PDLIM5 shRNA真核表达载体,获得干扰质粒稳定转染的SH-SY5Y(成神经细胞瘤细胞)细胞系。方法合成PDLIM5基因干扰序列并插到RNAi真核表达载体p GFP-V-RS质粒中,通过酶切和测序进行鉴定。常规培养SH-SY5Y细胞,将重组质粒PDLIM5 shRNA和对照质粒PDLIM5 Scramble经脂质体Lipofectamine 2000介导转染SH-SY5Y细胞,经puromycin持续筛选和有限稀释法获得稳定转染的细胞系。RT-PCR及Western blot分别检测PDLIM5 mRNA及蛋白表达情况。结果经双酶切及测序鉴定,重组获得的干扰真核表达质粒PDLIM5 shRNA与预期完全相同。PDLIM5 shRNA稳定转染SH-SY5Y细胞在荧光显微镜下呈亮绿色。RT-PCR及Western blot检测显示PDLIM5 mRNA及蛋白表达明显下调。结论成功构建PDLIM5 shRNA真核表达载体及其稳定转染SH-SY5Y细胞系,为进一步研究PDLIM5在精神疾病中的功能奠定实验基础。     

靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:针对β-连环蛋白(β-catenin)基因的不同部位,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒,鉴定并筛选出最佳抑制效率的表达质粒.方法:针对β-catenin基因的不同部位设计3对短发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸片段,克隆到真核表达载体pGPU6中,构建靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3.利用脂质体转染人胃癌细胞株AGS,Western blot法检测并筛选最佳抑制效率的shRNA表达质粒.结果:3个靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3经限制性酶切和测序确实基因插入正确,Western blot法证实pGPU6-B-catenin-shRNA-3明显降低细胞内β-catenin蛋白的表达.结论:成功构建了靶向β-catenin的shRNA真核表达质粒pGPU6-β-catenin-shRNA-1、2、3,并筛选出最佳抑制效率的表达质粒,为进一步研究Wnt/β-catenin信号通路在胃癌中的作用奠定了基础.     

EZH2 shRNA真核表达载体的构建及其在卵巢癌A2780细胞系的稳定表达

目的 采用基因工程技术,构建EZH2 shRNA的真核表达载体,获得稳定表达干扰质粒的卵巢癌A2780细胞系.方法 合成特异性干扰EZH2的shRNA片段并定向克隆插入Supersilencing shRNA质粒表达载体pGPU6/GFP/Neo,获得表达载体pGPU6/GFP/Neo-shEZH2.脂质体介导重组质粒转染A2780细胞,经G418加压筛选获得稳定转染细胞株,Real time RT-PCR和Western blot检测转染后细胞系EZH2的表达.结果 测序结果证实重组载体构建成功,稳定转染shEZH2的A2780细胞EZH2的mRNA和蛋白水平下降(90.20±1.66)%和(73.80±5.49)%,P＜0.01,差异有统计学意义. 结论成功构建EZH2 shRNA表达载体,获得EZH2基因稳定沉默的A2780细胞系,为进一步研究以EZH2为靶点的卵巢癌治疗奠定实验基础.     

细胞信号转导抑制因子3特异性shRNA的构建及鉴定

目的构建针对大鼠细胞信号转导抑制因子3(SOCS-3)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,选取最有效shRNA模板序列。方法设计并合成编码的shRNA的2条寡核苷酸序列,经退火成互补双链,再克隆至pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,进行序列测定;转染至骨骼肌细胞中。Real-time PCR和Western blot检测各组SOCS-3的表达情况。结果测序证实重组质粒构建成功。4对shRNA模板序列对SOCS-3的表达抑制与空白及阴性对照相比差异均有统计学意义(均P<0.05),且以SOCS-3-shRNA a干预效果较好。结论 SOCS-3特异性shRNA重组表达载体构建成功,能有效抑制大鼠骨骼肌细胞SOCS-3的表达,为后续研究及代谢综合征的基因治疗奠定了基础。     

人睾丸特异表达基因TDRG1shRNA表达载体的构建及其表达

目的:构建人睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达质粒, 并研究其在NTE-2 细胞中的表达。方法:设计合成有短发夹结构靶位TDRG1 基因的寡核苷酸, 经退火成双链, 克隆至载体pGPU6/GFP/Neo 中, 构建TDRG1shRNA 表达载体, 得到重组质粒TDRG1-shRNA486, TDRG1-shRNA738, TDRG1-shRNA921 和一个阴性对照, 使用Lipofectamine^TM 2000 转染shRNA 至NTE-2 细胞, 应用RT-PCR 法检测转染后NTE-2 细胞TDRG1 mRNA 的表达水平。结果:经测序证实, 插入的DNA 片段的序列与设计序列完全一致。同时筛选到转染TDRG1-shRNA486 的NTE-2 细胞TDRG1 基因的mRNA 表达水平明显抑制。结论:成功构建了人类睾丸基因TDRG1 的shRNA 表达载体, TDRG1-shRNA 在NTE-2 细胞内成功表达。     

Ｌｉｖｉｎ特异性ｓｉＲＮＡ表达载体在胃癌细胞中的稳定表达

目的:构建以Livin基因为靶基因的siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo/Livin,获得稳定沉默Livin基因的胃癌细胞SGC-7901/siRNA-Livin.方法:化学合成siRNA,Livin寡核苷酸,将其分别克隆进载体pGPU6/GFP/Neo,进行核酸序列测定.脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默效率,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆.结果:酶切分析显示,所有质粒均为阳性重组载体,核酸测序表明合成的序列准确插入pGPU6/GFP/Neo载体,G418筛选基因转染SGC-7901细胞后形成稳定克隆.其中pGPU6/GFP/Neo/Livin-4转染后Livin mRNA沉默效率大于70%.结论:成功获得Livin特异性siRNA表达载体,SGC-7901细胞Livin基因的表达受到抑制,转染胃癌细胞后获得SGC-7901/siRNA-Livin细胞克隆.     

NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立

目的 构建N-myc下游调节基因1（NDRG1）的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞（hCMECs）后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞。 方法 将pGPU6-GFP质粒采用BamH Ⅰ和Bbs Ⅰ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs。 结果 pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70%;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26%、21%和13%;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1 185和5 428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs。RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高。 结论 成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs。     

HPV6bL1短发夹shRNA表达质粒的构建及鉴定

目的 用pSilencer2.1质粒载体构建人类乳头瘤病毒6b型L1衣壳蛋白HPV6bL1短发夹shRNA质粒重组体,并进行序列分析,为探索尖锐湿疣基因抗体防治研究治疗的新途径打好基础.方法 用DNA重组技术将针对人HPV6bL1基因的不同部位所设计的3对设计有小发夹结构的2对DNA序列.经退火成互补双链,再克隆至pSilencer2.1-U6 neo质粒载体中构建重组体,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切鉴定后,进行测序分析.结果 成功构建了HPV6bL1shRNA质粒重组体.结论 HPV6bL1 shRNA质粒重组体的成功构建为研究尖锐湿疣基因靶向抗体打下基础.     

靶向表皮生长因子受体shRNA表达载体的构建和鉴定

目的构建靶向表皮生长因子受体（EGFR）的短发卡状RNA（shRNA）质粒表达载体并进行鉴定。方法①根据人类EGFR的mRNA序列,设计4条干扰片段,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,转化入DH5a大肠杆菌,提取质粒,进行酶切和测序鉴定;②采用脂质体Lipofectamin 2000分别转染人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞,用G418筛选阳性克隆。结果①经酶切及测序鉴定,成功构建了针对EGFR的4个重组干扰质粒;②成功转染Colo-16细胞,经筛选后得到稳定表达的细胞克隆。结论利用RNAi技术原理成功构建针对EGFR的shRNA重组质粒,并转染入Colo-16细胞。     

ＰＩ３-Ｋ／Ａｋｔ ｓｈＲＮＡ真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建针对P13-K/Akt基因的特异性短发卡RNA(shRNA)真核表达载体.方法:用DNA重组技术将针对大P13-K/Akt基因不同位点所设计的8个shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中.在酶切分析及序列测定后,用脂质体染至大鼠肾小球系膜细胞(GMCs).Western blot检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA.结果:限制性酶切及酸序列分析证明重组质粒正确.Western blot证实在重组质粒中shPik3c3-2、shAktl-4具有最佳沉默效率.结论:成功构建了PK/Akt shRNA的真核表达质粒.该实验结果为进一步研究P13-K/Akt信号通路的生物学功能奠定了基础.     

柯萨奇病毒B4双siRNA表达载体的构建及表达

目的：构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A。方法：选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo 和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达。结果：限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上。结论：针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上。     

RNAi沉默Fas受体表达的腺病毒载体构建

目的：利用pEGFP6-1和pGenesil—1质粒构建针对小鼠Fas的2个短发卡状RNA（shorthairpinRNA,shRNA）串联表达的载体pEGFP6-1—siFasl＋siFas2,进一步通过BDAdeno—X系统构建腺病毒表达Fas—shRNA载体。方法：设计表达2个短发卡状RNA结构的互补DNA序列分别克隆至质粒载体pEGFP6-1和pGenesil—1中,酶切pEGFP6-1—siFasl大片段和酶切pGenesil—1—siFas2小片段,经T4DNAI,igase连接得到pEGFP6-1—siFasl＋siFas2重组质粒。双酶切重组质粒和pshuttle2穿梭质粒。经T4DNA连接酶连接得到pShuttle2-siFasl＋siFas2质粒。双酶切重组穿梭质粒,连接酶切产物和腺病毒转化感受态E.coil DH5a,PCR筛选鉴定阳性克隆,进一步线性化重组腺病毒pAdeno—siFasl＋siFas2质粒,经脂质体转染HEK293A细胞;收细胞进行裂解收病毒。结果：构建的重组质粒载体经酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致;重组腺病毒载体经酶切鉴定和PCR分析正确：经HEK293A细胞包装成功,能够表达绿色荧光蛋白。结论：成功构建Fas—shRNA腺病毒串联表达载体。     

人上皮细胞黏附分子shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)基因为靶基因,构建shRNA重组表达载体。方法根据Gen Bank中Ep CAM序列(BC014785.1)的mRNA设计4组shRNA序列,插入p SGU6/GFP/Neo载体,构建重组载体,转化至Top10感受态细胞,经卡那霉素筛选并挑取阳性克隆,进行PCR鉴定及DNA测序分析。结果 PCR鉴定及DNA测序结果显示重组载体Ep CAM-p SGU6/GFP/Neo-shRNA构建成功。结论成功构建了干扰人Ep CAM基因的重组表达载体,为研究Ep CAM分子的生物学功能打下基础。