ANXA11表达稳定下调的肝癌Hca-P细胞株的建立

目的构建针对膜联蛋白A11(Annexin A11,ANXA11)的shRNA(small hairpin RNA),稳定转染小鼠低淋巴道转移力肝癌Hca-P细胞,筛选ANXA11稳定下调的单克隆细胞株,为后续研究奠定基础。方法合成2条ANXA11的shRNA序列(shRNA-1和-2),与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo连接,构建pGPU6/GFP/Neo-shR-NA-ANXA11表达载体并转染Hca-P细胞,通过G418筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,Western blot检测Hca-P细胞ANXA11蛋白表达,并与空载体转染及对照组比较。结果成功构建了pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11重组表达质粒,并获得pGPU6/GFP/Neo-shRNA-ANXA11-Hca-P单克隆细胞株;shRNA-1重组质粒的抑制效果在mRNA和蛋白水平对ANXA11抑制率分别为80.2%和77.7%,P<0.01。结论通过RNA干扰和基因转染技术成功建立了ANXA11表达稳定下调的Hca-P细胞株,得到了其单克隆细胞株,为进一步研究ANXA11在恶性肿瘤淋巴道转移中的作用及机制打下了基础。     

ANXAl1表达稳定下调小鼠肝癌Hca-F细胞株的构建

目的：构建膜联蛋白A11（annexinA11,ANXAll）稳定下调的小鼠肝癌高淋巴转移力细胞株Hca—F。方法：合成2条针对ANxAll的发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）序列shRNAl和shRNA2,连接到pGPU6／GFP／Neo质粒中,并转染到Hca—F细胞,获得了稳定转染的pGPU6／GFP／Neo—ANxAll-Hca—F细胞株。通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并利用RT—PCR和蛋白质印迹法验证ANXAll的表达变化。结果：成功构建了pGPU6／GFP／Neo—ANXAll重组表达质粒,并筛选出单克隆细胞;RT—PCR及蛋白质印迹法检测结果表明,与空白对照组比较,重组质粒pGPU6／GFP／Neo—A1l—Hca—F-1和2在mRNA水平,对ANXAll干扰率分别为（27．3±5．9）％和（58．3±12．4）％,P=0．001;在蛋白质水平,对ANXAll的下调率分别l为（57．4±4-0．9）％和（87．1±6．1）％,P〈0．001;shRNA-2对ANXAll的表达抑制效果更为显著,P〈0．001。结论：成功建立了ANXAll表达稳定下调的小鼠肝癌Hca—F细胞株,为进一步研究ANXAll在淋巴转移中的作用奠定前期基础。