膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

RNA干扰CD147稳定表达前列腺癌PC-3细胞株的建立

目的 为研究CD147分子在前列腺癌PC-3细胞中的生物学功能,通过RNA干扰(RNAi)技术建立稳定低表达CD147分子的前列腺癌PC-3细胞株.方法 利用脂质体2000将靶向CD147干扰质粒导入前列腺癌细胞中,干扰前列腺癌细胞中CD147分子的表达;有限稀释法获取单个细胞克隆,通过G418筛选出抗性克隆并利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和Western-blot免疫印迹法分别从转录水平和蛋白水平进行鉴定.结果 与转染pSilencer-Scramble对照质粒比较,转染pSilencer-CD147干扰质粒明显抑制CD147基因和蛋白表达水平(P<0.05).结论 靶向CD147的干涉载体能有效沉默PC-3细胞中CD147基因和蛋白的表达,通过G418筛选建立出稳定细胞株,为进一步研究CD147的功能打下基础.     

shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)的短发夹状RNA(shRNA)，观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达。方法：设计、合成含GFP编码基因片段，中间被4个bp间隔的反向重复序列，与转录载体pTZU6 1连接，构建pshRNA-GFP重组质粒，与pEGFP-C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721，检测其对GFP表达的影响。结果：pshRNA-GFP对共转染的pEGFP-C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用，抑制率达70％～85％。结论：构建的pshRNA-GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。     

siRNA转染浓度和时间对HeLa细胞ANXA5表达的抑制作用

目的：优化靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞的条件,为进一步研究ANXA5低表达对宫颈癌细胞生物功能的影响奠定基础。方法：将靶向ANXA5的siRNA转染HeLa细胞,设置不同的siRNA与脂质体的比值和转染时间,Western Blot检测ANXA5蛋白的表达。结果：siRNA与脂质体的比值为0.4：1时,转染入HeLa细胞72h后,HeLa细胞ANXA5蛋白的表达水平最低,即抑制作用最强。结论：siRNA与脂质体的比值和转染时间可影响HeLa细胞ANXA5的表达,存在最佳比值和转染时间。     

TWEAK在肝癌细胞系高/低淋巴道转移株中表达的初步分析

[目的]研究肿瘤坏死因子样弱凋亡因子（TWEAK）在小鼠腹水型肝癌细胞系高／低淋巴道转移株（Hca—F／Hca—P）中的表达及差异。[方法]分别提取Hca—F和Hca—P细胞的总RNA，通过RT—PCR在mRNA水平检测TWEAK基因的表达；提取Hca—F和Hca—P细胞的总蛋白，用蛋白印迹法从蛋白表达水平验证差异表达。[结果]RT—PCR检测到两株细胞均在358bo处出现特异性扩增的条带，并且Hca—F的条带亮度低于Hca—P，图像分析显示，Hca—F细胞中TWEAK的转录子含量低于Hca—P细胞（P〈0．05）；蛋白免疫印迹法验证两株细胞表面均有TWEAK蛋白的表达，Hca—P强于Hca—F，与基因芯片的结果一致。[结论]TWEAK在鼠腹水型肝癌细胞系Hca—F和Hca—P均有表达，且Hca—F中较低，而在Hca—P中表达较高。这说明了TWEAK可能与淋巴道转移有关，同时可能参与了细胞的凋亡与组织分化。     

稳定沉默GLI1基因的人胰腺癌细胞株的建立

目的建立稳定转染GLI1siRNA表达质粒的人胰腺癌细胞株,并鉴定其干扰效率。方法采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测5株人胰腺癌细胞中GLI1基因的表达,筛选出GLI1基因表达量最高的细胞作为目标转染细胞。脂质体转染法将构建好的3个干扰质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3分别转染入目标细胞,G418抗性筛选阳性克隆,荧光显微镜下观察转染效率。采用qRT-PCR法和蛋白质印迹法检测各组稳定转染细胞中GLI1mRNA及蛋白的表达水平,鉴定干扰效率。结果筛选出GLI1基因表达量最高的Panc-1细胞株作为目标转染细胞;3个干扰质粒均成功转染Panc-1细胞,G418筛选后获得稳定转染细胞Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3,荧光显微镜下可见3个质粒的转染效率均在80%以上;qRT-PCR及蛋白质印迹检测证实Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3细胞中GLI1mRNA和蛋白的表达水平均显著低于阴性对照质粒(Panc-1/siControl)转染细胞及空白对照细胞(P<0.05),其中Panc-1/GLI1siRNA-1细胞表达量最低。结论成功构建了稳定沉默GLI1基因表达的胰腺癌细胞株Panc-1/GLI1siRNA-1,为后续研究奠定了基础。     

乙酰肝素酶稳定表达细胞株的建立

目的:在真核细胞中表达人乙酰肝素酶(HPA)并建立该酶的稳定表达细胞株。方法:构建包含人乙酰肝素酶全长编码序列的真核表达载体pcDNA-hpaFL,转染CHO-K1细胞,G418筛选稳定表达细胞株。通过RT-PCR,Western-blot分析与鉴定蛋白的表达;用荧光HPLC法检测蛋白的活性。结果:在CHO-K1细胞中成功地表达出有活性的人乙酰肝素酶,并获得该酶的稳定表达细胞株。结论:成功地建立了人乙酰肝素酶稳定表达细胞株,为其抑制剂的筛选及其功能的研究奠定了基础。     

SiRNA稳定抑制肝癌细胞hTERT基因的表达

目的：利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因表达,探讨靶向hTERT基因RNAi与抑制肝癌细胞增殖的时-效关系．方法：设计靶向hTERT基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—hTERT并导入肝癌SMMC-7721细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA—hTERT的细胞株．采用real—time RT—PCR、MTF和PCR—TRAP法同时检测pGenesil—shRNA-hTERT稳定抑制组和未处理SMMC-7721细胞组hTERT基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化．结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—hTERT的SMMC-7721细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,hTERTmRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制．结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因hTERT mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是有潜力的基因治疗肿瘤新方法．     

下调FoxM1基因表达对宫颈癌细胞侵袭能力的影响

目的:研究靶向FoxM1基因的小分子干扰RNA(siRNA)下调宫颈癌Hela、C33A及Siha等细胞系FoxM1基因表达后细胞侵袭和迁移能力的改变,寻找新的宫颈癌治疗靶点。方法:设计靶向FoxM1基因小分子干扰RNA(siFoxM1)并分别转染宫颈癌细胞系Hela、C33A和Siha,实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测siFoxM1对细胞内源性FoxM1表达的影响;采用Transwell小室试验检测细胞迁移和侵袭能力改变。结果:1转染siFoxM1可特异高效地下调宫颈癌细胞FoxM1mRNA水平和蛋白表达水平,Hela、C33A和Siha细胞FoxMl mRNA分别下降92.29%,87.65%和95.82%;2细胞迁移试验显示3株细胞的平均OD值较对照组分别降低40.61%,49.65%和50.87%(P<0.05)。细胞侵袭试验显示3株细胞的平均穿膜细胞数较对照组分别降低86.67%,71.77%和72.48%(P<0.01)。结论:FoxM1基因表达下调可显著降低多株宫颈癌细胞侵袭和迁移能力,有可能成为有效的宫颈癌治疗靶点。     

体外RNA干扰下调ERM表达对胃癌SGC细胞转移能力的影响

 目的 探讨radixin和moesin是否也和ezrin一样在肿瘤转移中起调控作用。方法 选取ERM均表达的人胃癌SGC细胞作为模型,运用RNA干扰（RNAi）方法分别构建ezrin,radixin和moeisn表达特异性下调的稳定细胞株,并比较它们的体外转移能力。结果 体外细胞侵袭实验表明ERM中任一蛋白的特异性下调均能减弱细胞的转移能力,Western blot分析显示ERM中的任一蛋白的特异性下调均引起E-cadherin表达的明显增加。结论 3种ERM蛋白在SGC细胞的转移过程中都起重要的作用,下调ERM蛋白中的任一成员都能明显降低SGC细胞的转移能力,ERM与E-cadherin间的相互作用可能在肿瘤的发展过程中至关重要。我们的发现同时也为ERM功能冗余论提供了佐证。     

eola1下调表达对ECV304细胞增殖的影响

目的设计和构建人类新基因人内皮高表达脂多糖相关因子1(endothelium-overexpressed lipopolysaccharide-associated factor1, eola1)特异性的小干扰RNA表达载体sieola1,建立eola1下调表达模型,观察eola1下调表达对细胞增殖的影响.方法设计靶点特异性的寡核苷酸,连接到经BamHⅠ-HindⅢ酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上;转染重组质粒到ECV304细胞,通过定量RT-PCR实验检测靶基因的抑制情况;对转染sieola1质粒的细胞进行细胞计数,并应用流式细胞仪观察细胞周期的变化.结果构建的小RNA干扰质粒sieola1转染ECV304细胞能够抑制靶基因eola1的表达;细胞计数和流式细胞仪检测结果显示eola1表达抑制后,细胞生长周期延长.结论成功构建了针对eola1基因的siRNA质粒;细胞计数和流式细胞仪检测结果初步确认eola1具有抑制ECV304细胞增殖的作用.     

下调肝癌衍生生长因子表达水平对胶质瘤U373细胞增殖及凋亡的影响

目的:研究下调肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor,HDGF)的表达水平对胶质瘤细胞U373增殖及凋亡能力的影响。方法:设计并合成HDGF靶向siRNA,以脂质体为介质瞬时转染入U373细胞,采用RT-PCR及Western blot检测HDGF基因及蛋白表达水平的变化,判断RNA干扰的效果、流式及MTT法检测细胞凋亡及增殖变化。结果:用脂质体瞬时转染siRNA至U373细胞中,RT-PCR及Western blot实验结果证实转染48 h后,U373细胞中HDGF基因及蛋白表达水平明显下调。MTT结果显示,RNAi下调HDGF后的U373细胞相对于空白和阴性对照组,细胞在体外增殖能力明显减弱(P<0.01),U373细胞凋亡率明显上升(P<0.05)。结论:HDGF蛋白在胶质瘤的发生发展过程中起着促进作用,可能成为一个新的肿瘤分子治疗靶点。     

下调肝癌衍生生长因子表达水平对胶质瘤U373细胞增殖及凋亡的影响

目的：研究下调肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor,HDGF)的表达水平对胶质瘤细胞U373增殖及凋亡能力的影响。方法：设计并合成HDGF靶向siRNA,以脂质体为介质瞬时转染入U373细胞,采用RT-PCR及Western blot检测HDGF基因及蛋白表达水平的变化,判断RNA干扰的效果、流式及MTT法检测细胞凋亡及增殖变化。结果：用脂质体瞬时转染siRNA至U373细胞中,RT-PCR及Western blot实验结果证实转染48 h后,U373细胞中HDGF基因及蛋白表达水平明显下调。MTT 结果显示,RNAi下调HDGF 后的U373细胞相对于空白和阴性对照组,细胞在体外增殖能力明显减弱（P<0.01）,U373细胞凋亡率明显上升（P<0.05）。结论：HDGF蛋白在胶质瘤的发生发展过程中起着促进作用,可能成为一个新的肿瘤分子治疗靶点。     

稳定沉默黏着斑激酶结肠癌细胞株SW620的构建

目的：构建稳定沉默黏着斑激酶（FAK）结肠癌细胞株SW620。方法：用构建好的FAKRNA干扰（RNAi）慢病毒载体pLL3．7FAK及插入无沉默功能序列的阴性对照慢病毒载体pLL3．7,在293FT细胞中包装成慢病毒,感染体外培养结肠癌SW620细胞,作为实验组和阴性对照组,未感染病毒的SW620细胞作为未处理组,通过荧光倒置显微镜检测SW620细胞的感染效率,运用RT—PCR、Westernblot方法测定FAK的表达情况,建立稳定转染细胞株。结果：成功包装了靶向FAK的RNAi慢病毒,感染效率〉90％,稳定转染细胞株构建成功。RT—PCR及Westernblot方法检测发现实验组与阴性对照组及未处理组相比,FAK的表达明显降低。结论：稳定沉默FAK的RNAiSW620细胞构建成功。     

益气养阴方对小鼠肝癌及子宫颈癌肺转移抑制作用的实验研究

[目的]观察益气养阴方对小鼠肝癌及子宫颈癌肺转移的抑制作用。[方法]H22肝癌细胞悬液经小鼠尾静脉接种,观察荷瘤小鼠的肺部转移瘤情况;小鼠右下肢爪垫内侧皮下注射接种,复制淋巴道转移模型,观察小鼠实体瘤的瘤重量、抑瘤率、肺部转移率、淋巴结转移情况。U14子宫颈癌细胞悬液经小鼠肌肉接种,复制自发性转移模型,观察小鼠实体瘤的瘤重量、抑瘤率、肺部转移率。[结果]血道转移模型结果:中药组肺瘤结节数较造模组下降(21.13±7.95 v 34.11±12.14,P<0.05)。淋巴道转移模型结果表明:中药组肺瘤结节数、淋巴结指数较造模组均有下降(4.5±2.619 v 8.3±3.917和0.702±0.182 v 0.89±0.181,P<0.05)。自发转移模型结果:中药组移植瘤生长指数、肺转移瘤生长指数较造模组比均明显降低(0.059±0.013 v 0.086±0.024,P<0.01,3.899±1.356 v5.035±1.336,P<0.05)。[结论]益气养阴方对小鼠移植性肿瘤的生长及转移均有明显抑制作用,且能明显抑制肺转移瘤的生长。     

稳定过表达miR-26a肝癌细胞株的建立

目的建立稳定过表达miR-26a的肝癌细胞株。方法以CTE049质粒为模板,PCR扩增miR．26a序列418bp,片段两侧添加XbaI和BamHI酶切位点,In．Fusion克隆至pHAGE．fullEFla．MCS．IZsGreen中,次日挑选单菌落,提取质粒并进行测序和酶切鉴定;所构建的载体命名为pLVT．miR26a。获得pLVT．miR26a后,按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒包装和确认慢病毒是否成功生产;携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒感染小鼠肝癌细胞（Hepl．6）、人肝癌细胞（BEL．7402、HepG2、Sk—Hep．1、HepG2．1uc）,以建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞系：qRT．PCR检测所建立肝癌细胞系中miR26a的表达水平。结果测序和酶切证实成功构建了pLVT．miR26a,按标准程序生产的携带miR．26a和ZsGreen基因的慢病毒上清成功感染小鼠及人肝癌细胞。结论成功建立稳定过表达miR．26a的肝癌细胞株,为相关后续研究打下了良好基础。     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。