Schwann细胞转染Ha-Ras对β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ表达的影响

目的:研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha-Ras后β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ(β-1,4-galactosyltransferase Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ;β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ)表达变化.方法:构建Ha-Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞,将Ha-Ras表达质粒转染到Schwann细胞中.采用Northern Blot方法分析转染细胞中Ha-Ras转染情况和转染后β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ的表达变化.结果:原代Schwann细胞转染持续激活型Ha-Ras后,β-1,4-GalT-Ⅰ随转染时间延长而表达增高,而β-1,4-GalT-Ⅱ及Ⅴ的表达无变化.结论:β-1,4-GalT-Ⅰ随Schwann细胞转染时间Ha-Ras延长而表达增高,提示原代细胞表面的β-1,4-GalT-Ⅰ可能与Ha-Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关.     

Schwann细胞转染Ha-Ras对β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ表达的影响

目的：研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha-Ras后β1，4-半乳糖基转移酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ，(β-1，4-galactosyltransferaseⅠ，Ⅱ。Ⅴ；β-1,4-GalT-Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ)表达变化。方法：构建Ha-Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞，将Ha—Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用Northern Blot方法分析转染细胞中Ha-Ras转染情况和转染后β-1，4-GalT-Ⅰ，Ⅱ，Ⅴ的表达变化。结果：原代Schwann细胞转染持续激活型Ha-Ras后，β-1，4-GalT-Ⅰ随转染时间延长而表达增高，而β-1，4-GalT-Ⅱ及Ⅴ及的表达无变化。结论：β-1，4-GalT-Ⅰ随Schwann细胞转染时间Ha-Ras延长而表达增高，提示原代细胞表面的β-1，4-GalT-Ⅰ可能与Ha-Ras影响原代细晌增殖的信号途径相关。     

pEGFP-C2基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起来的核转染技术直接将编码绿色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞的细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以NucleofectorTM技术转染pEGFP-C2(EGFP组),以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。EGFP的表达逐渐增强,至第6天达到最高峰(47.8%),观察一个月未发现表达减弱。结论pEGFP-C2基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响;EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记;NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。     

Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景：Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路，建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义。 目的：以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞，构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型，观察经典Wnt信号通路对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响。 方法：将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定。应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞，经过G418筛选后挑出细胞克隆，扩大培养。应用RT-PCR技术检测表达产物，应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响。 结果与结论：Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒。经过G418筛选3周后，挑选10个稳定转染的细胞克隆，进行RT-PCR检测，可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320 bp亮带，表明扩增产物为所需要的目的片段，Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带。免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达，转染对照质粒组无表达。Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光，提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色，细胞核中无β-连环素蛋白的聚集。构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型，真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达，促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移。     

核转染增强型绿荧光蛋白对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响

目的研究以最近发展起来的核转染技术转染增强型绿荧光蛋白（EGFP）质粒进行基因修饰对兔原代骨髓基质细胞向神经细胞方向分化的影响。方法从兔股骨抽取骨髓，密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以Nucleofector^TM技术转染pEGFP—C2（EGFP组），以同期培养未转染的细胞作为对照组（control组）。以“CYTOKINE·神经干细胞培养基”＋10％胎牛血清诱导BMSCs向神经细胞方向分化。流式细胞仪检测转染效率。比较两组细胞的生长增殖以及Nestin、NSE、GFAP抗原的表达情况。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化以及生长曲线。诱导18d，两组细胞NSE、GFAP的表达比例无统计学意义。结论Nucleofector^TM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法；EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记；核转染pEGFP-C2对兔原代骨髓基质细胞体外增殖及向神经细胞方向分化无明显影响。     

突变SOD1 cDNA在大鼠皮层神经元定位和作用

目的:分析一个ALS家系突变铜、锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase,SOD1)基因在原代培养的大鼠皮层神经元中的定位及作用。方法:将构建好的含有SOD1正常基因与突变基因在内的增强型绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-hSOD1和pEGFP-mSOD1)分别转染大鼠皮层神经元,转染后观察绿色荧光在细胞内的分布情况,同时设对照组,检测神经元的SOD1活性、MDA含量及细胞活性。结果:转染后荧光物质表达于胞浆内,与转染pEGFP-mSOD1质粒的神经元相比,转染pEGFP-hSOD1质粒神经元的SOD1活性、MTT值显著增高,而MDA、LDH水平显著降低。结论:突变SOD1蛋白的酶活性下降,使脂质过氧化物相对增多,导致神经元损伤,可能是该家系发病的主要原因之一。     

脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞

背景：在体外将外源基因导入肝细胞相当困难,而利用肝脏干细胞导入外源性基因较为容易。目前大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立已较为成熟,但作为原代细胞,肝卵圆细胞的稳定培养和传代是较为困难的。 目的：建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染大鼠肝卵圆细胞的细胞株,观察转染细胞的生物学特性。 方法：取稳定培养的第4代雄性Lewis大鼠肝卵圆细胞,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到肝卵圆细胞,然后在倒置显微镜下观察转染细胞的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定转染细胞的稳定培养条件,使用western blot和ELISA方法检测转染细胞hHGF蛋白的表达。 结果与结论：第4代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的肝卵圆细胞在培养基中添加不同剂量和种类细胞因子的条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/肝卵圆细胞迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,western blot方法检测转染细胞有hHGF蛋白表达,ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高。结果提示,使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于肝卵圆细胞,转染细胞具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究。     

hTERT介导脐带间充质干细胞实现永生化的研究

目的 通过转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(hTERT)建立永生化脐带间充质干细胞(UCMSCs),用以获得足够多的UCMSCs满足体外研究与临床需要. 方法 原代分离培养人UCMSCs,取第4代UCMSCs行流式细胞术检测UCMSCs表面特异标志物表达:利用脂质体介导pLXSN-hTERT正义表达质粒转染UCMSCs,建立永生化UCMSCs:RT-PCR检测转染前后hTERTmRNA表达水平,细胞免疫荧光方法检测hTERT蛋白表达,流式细胞术观察hTERT转染后细胞周期改变. 结果 流式细胞术结果显示UCMSCs强表达CD29、CD44、CDl05,极低表达CD31、CD34、CD45,检测结果符合人UCMSCs特征;RT-PCR检测单纯UCMSCs低表达hTERT mRNA,pLXSN-hTERT正义表达质粒转染后hTERT mRNA表达明显增高;细胞免疫荧光显示hTERT全部表达于细胞核,转染后胞核荧光强度明显增强;细胞周期检测结果显示转染后处于S期UCMSCs数目明显增多,细胞可获得长期稳定传代(＞35代). 结论 以hTERT转染UCMSCs在体外可获得长期稳定传代培养细胞,可基本满足体外研究与临床需要.     

脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞：筛选理想浓度

背景：siRNA转染是完成RNA干扰的关键一步。目前用于心肌细胞的RNA干扰技术多以质粒为载体转染长链shRNA,其步骤复杂。脂质体转染化学合成短链siRNA是一种操作简便,低毒高效的转染方法,将其应用于心肌细胞转染,有利于RNA干扰技术的推广应用。 目的：筛选脂质体介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的最佳浓度,以及简单高效的RNA干扰操作方法。 方法：应用脂质体siPORTTM NeoFXTM转染试剂介导5,10,20,30 nmol/L的CY3-Negative siRNA转染心肌细胞,同时设立空白对照组,转染24 h后分别应用荧光显微镜,流式细胞仪检测转染效率和细胞凋亡率,筛选最优浓度。根据优化浓度转染PHB siRNA,48 h后检测蛋白表达验证转染效果。 结果与结论：随CY3-Negative siRNA浓度的增加,在荧光显微镜下观察到激发出红色荧光的细胞比例随之增加,流式细胞仪检测出各组平均转染效率也依次增高(P < 0.05),其中30 nmol/L组转染效率最高(P < 0.05),而各实验组与空白对照组之间的细胞凋亡率差异无显著性意义(P > 0.05)。将心肌细胞转染30 nmol/L 的PHB siRNA,48 h后PHB蛋白表达平均下降74.11%(P < 0.05)。实验结果表明,脂质体转染试剂siPORTTM NeoFXTM介导化学合成siRNA转染原代心肌细胞的理想浓度是30 nmol/L。     

Dickopff-1的真核表达载体构建及其对SHG44的作用

目的 构建Diekopff-1(DKK-1)的真核表达质粒,研究SHG44转染DKK-1并经BCNU处理后其生物学特性的变化.方法 将纯化扩增的人DKK-1与真核表达载体peDNA3.1连接后转化人大肠杆菌DH5α感受态扩增重组,以LipofectamineTM2000介导将重组质粒转染SHG44细胞,经G418筛选后进行鉴定.BCNU处理转染DKK-1基因后的SHG44细胞,流式细胞仪检测细胞特性变化.结果 扩增获得的816 bp特异片段,重组质粒经鉴定及测序分析结果 完全一致.重组载体转染SHG44细胞经G418筛选后,转染细胞在DNA、mRNA、蛋白水平均有DKK-1的表达.BCNU处理后的未转染、空质粒转染、重组质粒转染的三组SHG44细胞,平均凋亡率分别为1.0%、1.4%、8.0%.结论 本实验成功构建了pcDNA3.1-DKK-1真核表达质粒,并建立稳定表达DKK-1蛋白的胶质瘤细胞株(SHG44-DKK-1).转染DKK-1能增强SHG44对BCNU的敏感性,促进肿瘤细胞的凋亡.     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。     

稳定表达绿色荧光的大鼠胚胎来源肝干细胞

背景：胎肝来源肝干细胞作为细胞移植的供体来源具有优势,但有鉴于干细胞特质,其培养困难,传代后易分化生长;且现有干细胞示踪定位技术欠成熟,这些均是制约肝干细胞移植的重要因素。 目的：观察原代肝干细胞电转pEGFP-Cl质粒是否能获得稳定表达绿色荧光的肝干细胞。 方法：联合机械分离和胶原酶消化法体外分离孕13.5 d SD大鼠胚胎来源肝细胞,应用特异培养基培养分离细胞,随后通过半量换液法纯化出肝干细胞,采用细胞免疫荧光法对贴壁细胞进行鉴定,并用pEGFP-Cl质粒电转染原代肝干细胞后持续表达绿色荧光作示踪定位标志。 结果与结论：原代培养的胎肝干细胞24 h后可见细胞半贴壁,形态基本相同, 呈圆形或卵圆形;第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形;培养第3天出现一些由3,5 个形态一致的细胞集落, 细胞直径6~10 μm;细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚;第8天后细胞呈上皮样铺展;第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢;传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状;通过细胞免疫荧光法检测出培养第5天的贴壁细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19;经筛选pEGFP-Cl质粒电转染后的原代肝干细胞能稳定表达绿色荧光。实验成功构建转染了绿色荧光蛋白的肝干细胞。 关键词：肝干细胞;细胞培养;CD34;CK19;转染     

慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子基因的胎儿骨髓间充质干细胞的研究

目的 探讨胎儿骨髓间充质干细胞(fBMMSCs)经慢病毒转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因后GDNF的表达情况.方法 利用贴壁培养法,从流产胎儿的股骨骨髓中分离培养fBMMSCs,并进行扩增.取第5代fBMMSCs,用慢病毒载体转染GDNF基因.应用免疫组化法及ELISA法检测被转染的fBMMSCs GDNF的表达情况.结果 被转染GDNF基因的fBMMSCs GDNF表达阳性,且培养液中GDNF含量随培养时间延长而增高.结论 被慢病毒转染GDNF基因的fBMMSCs能表达GDNF.     

变异型IκBα抑制人类多形性胶质母细胞瘤细胞中血管生长因子VEGF及IL-8的表达

目的探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform,GBM)的细胞生长及其内血管内皮成长因子(VEGF)、白细胞介素-8(IL-8)表达的调控作用。方法通过构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达的筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株,进而检测转染后细胞的体外生长曲线,并运用Northern blot技术分析细胞内VEGF、IL-8在RNA水平的表达。结果用Western blot法成功筛选了转染的阳性细胞克隆,并发现转染后的人类GBM细胞与对照相比,体外生长曲线无明显差异,但其中VEGF、IL-8在RNA水平的表达量显著降低。结论IκBαM基因对人类GBM细胞中的血管生长因子VEGF、IL-8的表达具有抑制作用。     

原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞自分泌转化生长因子β1浓度检测及对转化生长因子β1增殖的调节

背景：体外实验常采用外源性转化生长因子β1刺激来观察细胞增殖变化，易忽略细胞本身自分泌转化生长因子β1的影响。 目的：检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞(L929)自分泌转化生长因子β1的浓度和细胞增殖的变化。 方法： Elisa试剂盒检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞各时相点细胞内和培养上清中生长转化因子β1水平。 结果与结论：纤维肉瘤细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而升高，原代成纤维细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而降低；两种细胞培养上清转化生长因子β1浓度均随时间而上升，但纤维肉瘤细胞显著高于原代成纤维细胞 (P < 0.01)，峰值时达到原代成纤维细胞的20倍；两种细胞增殖曲线在72 h内均随时间而显著增高(P < 0.01)，同一时间点比较，纤维肉瘤细胞明显高于原代成纤维细胞。提示自分泌转化生长因子β1具有促进细胞增殖的作用，不同的自分泌水平可能是影响原代成纤维细胞这种正常细胞和纤维肉瘤细胞肿瘤细胞对于外源转化生长因子β1反应不同的重要原因。     

大鼠骨髓间充质干细胞转染人TH基因的实验研究

目的评价酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)基因修饰骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)后TH的表达情况及转染TH基因对MSCs的影响.方法构建含人TH基因的pCMV/hTH质粒,用脂质体转染原代培养的大鼠MSCs;Western blot及免疫细胞化学染色鉴定TH基因的表达及MSCs的分化情况;MTT比色法测定转染后的MSCs细胞活性,并与未转染的MSCs进行细胞活性比较.结果构建的pCMV/hTH质粒经ECoRI酶切后产生1.9okb和5.3kb的片段,与回收的目的基因及载体基因片段大小相符;转基因后的MSCs Western blot及免疫细胞化学染色显示TH染色阳性;转染后MSCs未见有NeuN,GFAP的表达;MTT比色法测定细胞活性,未转染与转染者差异无显著性.结论构建的TH基因能在体外培养的鼠MSCs中较好的表达,转染不会诱导MSCs向神经样细胞分化,对MSCs细胞活性无明显影响.     

Hax-1对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用

目的 探讨造血干细胞特异性相关结合蛋白-1（Hax-1）对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 选择2018年9月至2019年6月手术切除并得到术后病理证实的胶质瘤组织35例和颅脑损伤内减压术切除的正常脑组织35例,采用qRT-PCR检测Hax-1 mRNA水平;同时检测胶质瘤细胞系（U87、A172、T98及U343）和人星形胶质细胞（NHAs）Hax-1 mRAN水平。使用Lipofectamine 2000法将Hax-1 siRNAs和阴性对照siRNA转染U87细胞构建Hax-1低表达细胞株,将Hax-1高表达质粒和PCDNA3.1空载质粒转染U343细胞构建Hax-1过表达细胞株,使用蛋白印迹法验证转染效果,采用CCK-8法检测细胞增殖,采用Transwell小室实验检测细胞迁移和侵袭,免疫印迹法检测NF-κB信号通路相关蛋白表达水平（NF-κB、CCND1、C-myc、MMP-2、MMP-9）。结果 胶质瘤组织Hax-1 mRNA水平明显高于正常脑组织（P<0.05）;胶质瘤细胞系（U87、A172、T98及U343）Hax-1 mRNA水平明显高于人星形胶质细胞（P<0.05）,其中U87细胞Hax-1 mRNA水平最高,U343细胞最低。U343细胞转染Hax-1过表达质粒后,Hax-1蛋白水平显著增高（P<0.05）,细胞增殖、侵袭、迁移能力均明显增强（P<0.05）,NF-κB p65及IκBα蛋白磷酸化水平以及CCND1、C-Myc、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显增高（P<0.05）。U87细胞转染Hax-1 siRNA后Hax-1蛋白水平显著降低（P<0.05）,细胞增殖、侵袭、迁移能力均明显降低（P<0.05）,NF-κB p65及IκBα蛋白磷酸化水平以及CCND1、C-Myc、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。结论 胶质瘤组织Hax-1呈高表达,明显促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移,其机制可能与激活NF-κB信号通路有关。     

RhoE表达上调对U87细胞NF-κB活性的影响

目的探讨RhoE对转录因子NF-κB活性水平的影响。方法将包含RhoE基因的质粒转染胶质瘤U87细胞;免疫印迹实验分析NF-κB亚单位p65在胞浆和胞核中的蛋白表达水平;细胞免疫化学实验检测p65在细胞中的蛋白表达水平和亚细胞定位;免疫印迹实验检测Ikkβ和IκBα蛋白表达水平。结果将pC MVFlA G-RhoE质粒成功转染U87细胞后,免疫印迹实验显示,胞浆和胞核中p65的蛋白表达水平均较对照组下降;细胞免疫化学结果亦表明,p65在细胞核中的定位量明显减少。免疫印迹实验进一步分析显示,NF-κB上游调控分子IκBα表达增加,而Ikkβ表达减少。结论上调RhoE表达水平能够抑制U87细胞转录因子NF-κB活性水平。NF-κB活性的降低可能与RhoE调控Ikk/IκBα机制相关。     

内皮抑素抑制胶质瘤多药耐药细胞株GL15细胞磷酸糖蛋白的表达及其意义

目的 研究内皮抑素对阿霉素(ADM)诱导的大鼠胶质瘤多药耐药细胞株GL15(GL15/ADM)细胞磷酸糖蛋白(P-gp)表达的抑制作用,探讨其对胶质瘤肿瘤耐药的影响.方法 将内皮抑素质粒转染胶质瘤耐药细胞,应用免疫印迹法、荧光分光光度计和流式细胞术分别检测转染后6,12,24,48 h不同时间段P-gp表达水平及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的活性和细胞凋亡率.结果 转染后6 h即可发现P-gp表达水平活性明显降低(P<0.05),且随转染后时间的延长而递减;转染后6h即可发现caspase-3活性明显上升(P<0.05),且随时间的延长而递增;转染后6、12、24、48 h肿瘤细胞凋亡率上升,并与非转染组间有极显著性差异(P<0.01).结论 内皮抑素能通过上调Caspase-3的活性,明显抑制胶质瘤耐药细胞中P-gp表达水平和促进肿瘤细胞凋亡,有助于提高胶质瘤的综合治疗效果.     

碱性成纤维细胞生长因子-慢病毒真核表达载体的构建及转染

背景：以往研究多采用质粒载体,由于其转染效率不高,且转染时需借助脂质体转染剂进行转染,转染具有细胞毒性,操作复杂等难以应用于临床。 目的：构建携带人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)基因的慢病毒载体,转染成骨方向诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定bFGF基因表达。 方法：实验组：设计人bFGF基因引物,用Trizol法提取胎盘组织RNA,用RT-PCR的方法扩增出bFGF基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,经Xho-Ⅰ、BamH-Ⅰ双酶切和DNA测序证实质粒正确构建。在脂质体转染剂Lipofectamine 2000的介导下,将bFGF-pLenti6/V5-D-TOPO表达质粒同包装质粒pLP1、pLP2、 包膜质粒pLP/VSVG 共转染293FT细胞株,收集bFGF-慢病毒上清转染诱导后第2代的兔BMSCs。对照组：设计GFP基因引物,以GFP- PMSLV-Plazmid为模板,PCR的方法扩增出GFP基因,连接至pLenti6/V5-D-TOPO® 表达质粒,构建GFP-慢病毒载体,并转染BMSCs。RT-PCR和Wetern-blot方法检测bFGF、GFP基因的表达。 结果与结论：转染48 h后,对照组BMSCs可见绿色荧光蛋白表达;实验组BMSCs在转染15 d后,RT-PCR方法扩增出bFGF基因,Western-blot检测出目的蛋白表达。提示成功构建携带人bFGF和GFP基因的真核表达载体,建立转染兔BMSCs的方法。