Schwann细胞转染Ha-Ras对β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ表达的影响

目的:研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha-Ras后β1,4-半乳糖基转移酶Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ(β-1,4-galactosyltransferase Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ;β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ)表达变化.方法:构建Ha-Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞,将Ha-Ras表达质粒转染到Schwann细胞中.采用Northern Blot方法分析转染细胞中Ha-Ras转染情况和转染后β-1,4-GalT-Ⅰ,Ⅱ,Ⅴ的表达变化.结果:原代Schwann细胞转染持续激活型Ha-Ras后,β-1,4-GalT-Ⅰ随转染时间延长而表达增高,而β-1,4-GalT-Ⅱ及Ⅴ的表达无变化.结论:β-1,4-GalT-Ⅰ随Schwann细胞转染时间Ha-Ras延长而表达增高,提示原代细胞表面的β-1,4-GalT-Ⅰ可能与Ha-Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关.     

Schwann细胞转染Ha-Ras对 β_1 ,4-半乳糖基转移酶I,II,V表达的影响

目的 :研究原代Schwann细胞转染持续激活型原癌基因Ha Ras后β1,4 半乳糖基转移酶I,II ,V(β 1,4 galactosyltransferaseI ,II ,V ;β 1,4 GalT I,II,V)表达变化。方法 :构建Ha Ras表达质粒和分离纯化大鼠Schwann细胞 ,将Ha Ras表达质粒转染到Schwann细胞中。采用NorthernBlot方法分析转染细胞中Ha Ras转染情况和转染后β 1,4 GalT I,II,V的表达变化。结果 :原代Schwann细胞转染持续激活型Ha Ras后 ,β 1,4 GalT I随转染时间延长而表达增高 ,而 β 1,4 GalT II及V的表达无变化。 结论 :β 1,4 GalT I随Schwann细胞转染时间Ha Ras延长而表达增高 ,提示原代细胞表面的 β 1,4 GalT I可能与Ha Ras影响原代细胞增殖的信号途径相关。     

Wnt3a转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞及对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响

背景：Wnt信号通路是动物胚胎发育过程中重要的调控通路，建立Wnt信号通路细胞模型对于研究该通路有重要意义。 目的：以Wnt3a真核表达质粒转染小鼠胸腺激酶缺陷细胞，构建能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型，观察经典Wnt信号通路对β-连环素蛋白亚细胞分布的影响。 方法：将扩增真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0进行酶切鉴定。应用脂质体转染技术将真核表达质粒pgk-Wnt3a-pcDNA3.0和对照质粒pgk-neo-pcDNA3.0转染入胸腺激酶缺陷细胞，经过G418筛选后挑出细胞克隆，扩大培养。应用RT-PCR技术检测表达产物，应用间接免疫荧光技术检测Wnt3a对鼠胸腺激酶缺陷细胞β-catenin亚细胞分布的影响。 结果与结论：Wnt3a质粒经过酶切鉴定证明所扩增的质粒为目的质粒。经过G418筛选3周后，挑选10个稳定转染的细胞克隆，进行RT-PCR检测，可见在L-Wnt3a细胞的cDNA产生1条长度为320 bp亮带，表明扩增产物为所需要的目的片段，Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后有Wnt3a在mRNA转录水平表达。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞cDNA未扩增出目的条带。免疫荧光检测可见Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞后细胞浆中有Wnt3a蛋白表达，转染对照质粒组无表达。Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞核中可见明亮的红色荧光，提示β-连环素蛋白在胸腺激酶缺陷细胞-Wnt3a细胞聚集并进入细胞核中。转染对照质粒的胸腺激酶缺陷细胞浆未见有明显β-连环素蛋白着色，细胞核中无β-连环素蛋白的聚集。构建了能够持续激活Wnt信号通路的体外细胞模型，真核表达Wnt3a质粒转染胸腺激酶缺陷细胞能够获得稳定表达，促进胸腺激酶缺陷细胞浆中β-连环素蛋白向细胞核转移。     

脊髓损伤过程中β-1,4半乳糖基转移酶的表达研究

目的 探讨β-1,4半乳糖基转移酶(β-1,4-GalT)在横断性脊髓损伤后的时空表达变化以及细胞定位情况.方法 将42只成年SD大鼠随机分为假手术组和T9横断伤8 h、1 d、3 d、5 d、7 d、14 d组,每组6只.采用实时定量PCR测定损伤后各时间段β-1,4-GalT在脊髓中的表达变化;采用原位杂交与免疫荧光标记方法检测β-1,4-GalT在脊髓中的分布以及伤后的定位改变.结果 脊髓横断损伤后,β-1,4-GalT-Ⅴ在损伤上、下段表达高峰分别出现在损伤后8 h和1 d,之后逐渐下降,至伤后14 d降低至假手术组水平.增高的mRNA主要分布于损伤周围的细胞中及脊髓后角浅层的感觉神经元中.荧光原位杂交结果显示,β-1,4-GalT-Ⅴ主要分布于巨噬细胞和小胶质细胞以及病理状态下的少突胶质细胞.同时β-1,4-GalT-Ⅴ mRNA在损伤后大量表达于富含P物质和IB-4的脊髓后角浅层的感觉神经元中.结论 脊髓损伤后β-1,4-GalT在基因和细胞水平呈现明显的时空变化,并且与巨噬细胞和小胶质细胞以及病理状态下的少突胶质细胞存在共定位.该酶可能参与了损伤后的继发性损伤,即伤后早期的炎性反应,并可能与脊髓损伤后的神经病理性疼痛有关.     

Smad4 siRNA对转化生长因子β诱导Ⅰ型胶原表达的作用

背景：近期研究表明,阻断smad传导通路可能成为一个阻断转化生长因子β引起的肝纤维化的新的靶点。 目的：验证Smad4小分子干扰RNA(siRNA)对转化生长因子β诱导的Ⅰ型胶原的作用。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2006-09/2008-10在哈尔滨医科大学药学院完成。 材料：肝星状细胞HSC-T6体外培养,siRNA和荧光素酶报告基因采用Lipofectamine试剂转染,以含巨细胞病毒-β-半乳糖苷酶质粒作为转染阳性对照。 方法：根据不同处理将细胞分为4组,空白对照组;Smad4 siRNA转染组;转化生长因子β处理组;Smad4 siRNA转染后转化生长因子β处理组,将Smad4 siRNA转染入肝星状细胞后行转化生长因子β刺激。各组分别于培养24 h后收集细胞。 主要观察指标：利用荧光素酶报告基因法测定Smad结合转写因子(4XSBE)的活性;反转录-聚合酶链反应法检测Ⅰ型胶原mRNA表达的变化;Western印迹分析观察Smad4蛋白、Ⅰ型胶原蛋白的变化。 结果：Smad4 siRNA有意义的抑制Smad4蛋白表达;Smad4 siRNA抑制转化生长因子β诱导的4XSBE转录报告基因的活性;Smad4 siRNA从mRNA和蛋白水平有效抑制转化生长因子β激活的Ⅰ型胶原的表达。 结论：Smad4 siRNA能够有效地阻断转化生长因子β诱导的Ⅰ型胶原表达。     

原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞自分泌转化生长因子β1浓度检测及对转化生长因子β1增殖的调节

背景：体外实验常采用外源性转化生长因子β1刺激来观察细胞增殖变化，易忽略细胞本身自分泌转化生长因子β1的影响。 目的：检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞(L929)自分泌转化生长因子β1的浓度和细胞增殖的变化。 方法： Elisa试剂盒检测原代成纤维细胞和纤维肉瘤细胞各时相点细胞内和培养上清中生长转化因子β1水平。 结果与结论：纤维肉瘤细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而升高，原代成纤维细胞内转化生长因子β1浓度随培养时间延长而降低；两种细胞培养上清转化生长因子β1浓度均随时间而上升，但纤维肉瘤细胞显著高于原代成纤维细胞 (P < 0.01)，峰值时达到原代成纤维细胞的20倍；两种细胞增殖曲线在72 h内均随时间而显著增高(P < 0.01)，同一时间点比较，纤维肉瘤细胞明显高于原代成纤维细胞。提示自分泌转化生长因子β1具有促进细胞增殖的作用，不同的自分泌水平可能是影响原代成纤维细胞这种正常细胞和纤维肉瘤细胞肿瘤细胞对于外源转化生长因子β1反应不同的重要原因。     

外源Smad7转染肝星状细胞及对转化生长因子β1和Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达的影响

背景：Smad7是转化生长因子β信号转导途径的主要抑制性蛋白,具有抗纤维化的作用。 目的：构建并鉴定大鼠Smad7真核表达质粒,观察外源Smad7可否有效转染肝星状细胞T6,并进一步研究其对转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA 表达水平的影响。 设计、地点：基因重组及细胞观察实验,于新疆石河子大学医学院第一附属医院完成。 材料：pcDNA3.1(+)质粒为课题组保留;大肠杆菌DH5α系石河子大学医学院新疆地方与民族高发病教育部重点实验室所赠;肝星状细胞T6细胞由中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所提供品。 方法：采用基因重组技术将Smad7cDNA插入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建大鼠Smad7真核表达质粒。脂质体介导转染肝星状细胞T6细胞,分为正常对照、空质粒及转染组,G418筛选,挑取阳性细胞。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应法检测各组中Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平。 结果：酶切和测序结果证实Smad7真核表达质粒构建成功。Smad7转染组与正常对照组、空质粒组比较：Smad7 mRNA表达显著增加(P < 0.01);转化生长因子β、Ⅰ型胶原mRNA表达减少(P < 0.01);Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P > 0.05)。正常对照组、空质粒组Smad7、转化生长因子β及Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA表达差异无显著性意义(P值均> 0.05)。 结论：大鼠Smad7真核表达质粒构建成功,外源Smad7转染肝星状细胞T6细胞后可有效表达,并能降低转化生长因子β及Ⅰ型胶原mRNA 表达水平。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。     

转化生长因子β1基因转染鼠脂肪间充质干细胞的可行性☆

背景：脂肪间充质干细胞在转化生长因子β1等生长因子的调控下可被诱导分化为软骨细胞。然而,外源性转化生长因子β1存在引起趋化性、激发炎症反应、造成局部损伤、有效成分容易被稀释或丢失、半衰期短、缺少理想的转运蛋白等缺陷。因此,利用基因重组技术,使种子细胞表达转化生长因子β1,对软骨组织工程的进一步发展具有重要的指导意义。 目的：探讨真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒的构建方法,并观察其转染脂肪间充质干细胞的可行性。 方法：利用基因重组技术,将大鼠转化生长因子β1全长基因的PCR产物与克隆载体pT7Blue连接,并用大肠杆菌筛选阳性重组体构建真核表达质粒,采用XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切及测序方法对质粒进行鉴定;将已经纯化的pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒和空载体pcDNA3.1质粒分别采用阳离子脂质体试剂LipofectamineTM2000转染脂肪间充质干细胞,经G418抗性筛选后扩大培养,同时用pcDNA3.1-绿色荧光蛋白观察转染效率。 结果与结论：重组质粒经XboⅠ、Hind Ⅲ双酶切后出现1.35 bp和5.4 kb 2条带,测序结果显示重组质粒所包含的转化生长因子β1全长碱基序列完全正确,绿色荧光蛋白显示其转染脂肪干细胞的转染效率> 80%,且转染细胞后有转化生长因子β1 mRNA和蛋白的表达上调。提示利用基因重组技术可成功构建能转染脂肪间充质干细胞的真核表达载体pcDNA3.1-转化生长因子β1质粒。     

NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨NEDD4-1 shRNA对U251胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法构建NEDD4-1 shRNA表达载体。以不同比例质粒和脂质体转染U251细胞,通过荧光显微镜观察细胞存活情况,优化转染效率。转染48 h后采用Western blot、RT-PCR分别检测NEDD4-1蛋白及mRNA的表达,流式细胞术检测细胞周期,MTT法检测细胞增殖,DAPI荧光染色检测细胞凋亡。结果 NEDD4-1 shRNA表达载体构建成功。脂质体与质粒的最佳转染效率比例为2.5μl∶1μg,48 h转染效率在60%～70%。与对照组比较,转染NEDD4-1 shRNA后,U251胶质瘤细胞NEDD4-1的蛋白及mRNA表达水平均下降(均P<0.05),细胞大多停滞在G0-G1期(均P<0.05),增殖率明显降低(均P<0.05),凋亡率显著增加(均P<0.05)。结论 NEDD4-1作为PTEN泛素连接酶,为胶质瘤基因治疗提供靶点。     

反转录病毒载体介导转化生长因子β1基因体外转染兔膝关节软骨细胞的表达

背景：将功能基因片段整合到基因载体内,再将基因载体转染入靶细胞中或转染入关节腔内,通过转基因的靶细胞持续大量分泌功能基因产物,在一个较长的时期内保持局部治疗浓度,可修复关节软骨损伤。 目的：以重组反转录病毒载体介导转化生长因子β1体外转染兔膝关节软骨细胞,观察其表达情况及其对软骨细胞生物学性状的影响。 方法：采用胰酶消化法分离培养兔软骨细胞。载体经PLNCX2 Hind Ⅲ/Not Ⅰ双酶切、去磷酸化后,与载体pDsRed2双酶切得到大的部分多克隆位点和RFP基因连接,构建PLNCX2-RFP。转化生长因子β1基因从PGEMT-TGF中扩增,经双酶切后与PLNCX¬2-RFP连接,构建PLNCX2-TGFβ1-RFP。包装反转录病毒载体,并检测病毒上清滴度。将培养的兔膝关节软骨细胞分组转染：对照组(不做任何转染)、转染PLNCX2组、转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组,持续筛选2周,观察细胞变化。收集稳定转染的细胞上清液,以NO检测试剂盒检测基因转染对软骨细胞的影响,以ELISA法检测细胞培养上清液中人转化生长因子β1表达。 结果与结论：重组基因PLNCX2-TGFβ1-RFP经酶切鉴定测序TGFβ1、RFP、序列均正确,表明构建成功预期的真核表达载体PLNCX2- TGFβ1-RFP。转染到包装细胞并筛选培养后,病毒滴度为1×106 CFU。稳定转染软骨细胞后可观察到红色荧光,证明转染成功。持续筛选2周,散在贴壁细胞形成阳性克隆,逐渐弥漫融合,并有细胞簇出现,双核多见,细胞增生活跃。转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组NO浓度高于对照组、转染PLNCX2组(P < 0.05),对照组、转染PLNCX2组间差异无显著性意义。对照组与转染PLNCX2¬组均无转化生长因子β1表达,转染PLNCX2-TGFβ1-RFP组转化生长因子β1质量浓度为(28.08±3.73) ng/L。提示反转录病毒载体PLNCX2介导的人转化生长因子β1能有效转染到兔膝关节软骨细胞并获得稳定表达,同时转染后的软骨细胞增生活跃。     

小鼠胚胎干细胞Notch1基因沉默对糖原合酶激酶3β和周期蛋白依赖性激酶5表达的影响

背景：GSK-3β与CDK-5都属于磷酸化蛋白激酶，一并参与胚胎神经细胞分化发育具体机制尚不清楚。 目的：观察胚胎干细胞Notch1基因沉默后Hes-1、PS1、Gsk-3β和Cdk5表达的变化以及Notch信号对Gsk-3β和Cdk5表达的调节作用及对早期神经细胞分化发育的潜在影响。 方法：通过阳离子脂质体转染法将Notch1 siRNA真核表达载体转入小鼠胚胎干细胞。倒置显微镜下观察转染前后细胞的形态变化；48 h后收集细胞，RT-PCR检测包括Notch1在内的Hes-1、PS1、Gsk-3β和Cdk5基因水平表达情况，单因素方差分析各组间差异。 结果与结论：①RT-PCR检测到转染pSINsi-U6-Notch1质粒组胚胎干细胞Notch1、Hes-1、GSK-3β和Cdk5的表达情况较转染空质粒组与正常对照组显著降低(P < 0.05)，转染空质粒组与正常对照组之间无明显差异(P > 0.05, n=5)。②倒置显微镜下观察未见外源质粒的转入对胚胎干细胞克隆性生长的影响，只是转染pSINsi-U6-Notch1质粒组胚胎干细胞的增殖量较其他两组有所降低。③胚胎干细胞PS1表达情况3组间无显著差异(P > 0.05)。可以看出，胚胎干细胞Notch1基因表达水平的降低导致蛋白激酶GSK-3β、Cdk5表达的下调。     

生长分化因子5真核表达质粒转染小鼠骨髓基质干细胞体外诱导向软骨细胞分化

背景：生长分化因子5是软骨与骨组织形成、发育的重要调解因子,在诱导软骨形成,促进骨、软骨、肌健韧带损伤修复方面发挥重要作用。 目的：小鼠骨髓基质干细胞体外转染真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5,检测与软骨形成分化相关的细胞外基质及蛋白多糖的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/12在武汉协和医院中心实验室完成。 材料：雄性昆明种小鼠20只,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。生长分化因子5真核表达质粒pcDNA 3.1(+)/生长分化因子5为自备。 方法：全骨髓贴壁法体外分离培养小鼠骨髓基质干细胞,取传至第3代细胞接种到6孔板,在细胞生长到90%融合时开始转染。设立3组：转染组采用LipofectamineTM2000进行脂质体介导pcDNA3.1(+)/生长分化因子5重组质粒瞬时转染;空质粒组转染空质粒pcDNA 3.1(+);空白对照组只加入等量脂质体,其余步骤相同。 主要观察指标：转染后72 h通过RT-PCR及免疫细胞化学检测生长分化因子5基因与蛋白的表达鉴定转染是否成功,同法检测软骨基质Ⅱ型胶原的表达,转染后14 d阿尔辛蓝染色检测蛋白聚糖的表达。 结果：转染组有一大小为219 bp的特异性扩增条带,骨髓基质干细胞胞浆内呈棕色阳性染色;而空质粒组、空白对照组均未发生生长分化因子5基因转录,无特异性扩增条带,且细胞胞浆未见明显染色。转染组可检测到Ⅱ型胶原基因的表达,基因大小225 bp,Ⅱ型胶原细胞胞浆中可见棕黄色染色;空质粒组、空白对照组均未检测到Ⅱ型胶原基因的表达,SP染色均无明显染色。阿尔辛蓝染色后转染组细胞呈蓝染,空质粒组、空白对照组均未见明显异染性着色。 结论：pcDNA3.1(+)/生长分化因子5转染骨髓基质干细胞能显著增加Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的表达,促进骨髓基质干细胞向软骨细胞方向分化。     

早老素-1V97L基因突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响

目的 探讨早老素-1(presenilin-1,PS-1)Val97Leu位点突变对家族性Alzheimer病SH-SY5Y细胞Aβ42产生的影响.方法采用一步法定点突变技术,由含有野生型(wild type,wt)PS-1的pcDNA3.1/Zeo(+)质粒合成携带有突变位点Val97Leu的突变型(mutation type,mt)PS-1质粒并转染至神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y细胞中,筛选出稳定表达的细胞系.用ELISA法和放射免疫法来检测培养基及胞浆中Aβ42和总Aβ含量;同时检测APP及BACE表达水平的变化.结果48小时,转染突变PS-1基因的细胞,细胞内和细胞外Aβ42的含量较24小时有显著提高,且相对未转染、wt和mock转染的细胞也有显著提高,而各组间总Aβ的含量变化无明显差异.APP及BACE的表达水平各组间也无明显差异.结论 此中国人阿尔茨海默病家系中发现的PS-1基因Val97Leu突变为一新的突变位点,可选择性引起细胞内外Aβ42的增高,因此认为是一病理性突变.     

胰岛素样生长因子1基因转染兔脂肪间质干细胞的增殖

背景：基因工程是目前软骨修复的主要方法,脂肪间质干细胞以其来源丰富、取材容易、免疫相容性良好、体外培养可以较长时间保持分化表型、有较强的向软骨细胞转化的能力而成为理想的种子细胞。 目的：探讨胰岛素样生长因子1基因转染对兔脂肪间质干细胞增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学基因转染体外观察,于2006-03/2007-03在中国医科大学细胞生物实验室完成。 材料：成年新西兰大白兔3只,由中国医科大学实验动物中心提供。含有全长人胰岛素样生长因子1 cDNA片段的质粒pcDNA3.1-hIGF-1由吉林大学徐莘香教授惠赠。 方法：取兔颈后皮下脂肪,I型胶原酶消化法体外分离培养兔脂肪间质干细胞。取传至第2代细胞,以0.5×106/孔密度接种于6孔板,细胞融合至90%~95%时随机分为未转染组、转染空载体pcDNA3.1组、转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组,采用脂质体介导基因转染法进行质粒pcDNA3.1-IGF-1转染,经G418筛选后培养4周。 主要观察指标：采用RT-PCR及Western blot方法检测胰岛素样生长因子1的表达情况,MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖情况。 结果：转染pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞内有大量胰岛素样生长因子1 mRNA及蛋白表达,未转染组及转染空载体pcDNA3.1组无表达。细胞增殖曲线显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞增殖速度较其他2组细胞明显加快。流式细胞仪检测显示,转染质粒pcDNA3.1-hIGF-1组的脂肪间质干细胞较其他2组细胞的S期比例显著增加(P < 0.05),G1期比例显著下降(P < 0.05)。 结论：质粒pcDNA3.1-IGF-1转染兔脂肪间质干细胞后,可以获得稳定表达,并能明显促进脂肪间质干细胞的增殖。     

脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染Lewis大鼠肝卵圆细胞

背景：在体外将外源基因导入肝细胞相当困难,而利用肝脏干细胞导入外源性基因较为容易。目前大鼠肝卵圆细胞增殖模型的建立已较为成熟,但作为原代细胞,肝卵圆细胞的稳定培养和传代是较为困难的。 目的：建立pBLAST2-hHGF质粒稳定转染大鼠肝卵圆细胞的细胞株,观察转染细胞的生物学特性。 方法：取稳定培养的第4代雄性Lewis大鼠肝卵圆细胞,采用脂质体介导DNA转染的方法将pBLAST2-hHGF质粒转染到肝卵圆细胞,然后在倒置显微镜下观察转染细胞的形态变化、细胞增殖情况,检测细胞转染后的增殖分化能力,确定转染细胞的稳定培养条件,使用western blot和ELISA方法检测转染细胞hHGF蛋白的表达。 结果与结论：第4代以脂质体介导成功转染pBLAST2-hHGF质粒的肝卵圆细胞在培养基中添加不同剂量和种类细胞因子的条件下转染细胞可稳定传代14代,其形态与未转染细胞比较无明显变化,但生长增殖速度明显快于未转染细胞,去除培养液中的生长因子后pBLAST2-Hhgf/肝卵圆细胞迅速分化为肝细胞和胆管上皮细胞,western blot方法检测转染细胞有hHGF蛋白表达,ELISA法检测培养液中hHGF蛋白含量高。结果提示,使用脂质体介导pBLAST2-hHGF质粒转染肝卵圆细胞方法可靠,转染细胞稳定培养并传代次数长于肝卵圆细胞,转染细胞具备分泌hHGF的能力,可用于后续研究。     

基因转染促骨髓间质前体细胞体外向软骨的分化**☆

目的：骨髓中包含的间质前体细胞在适宜的条件下可以被许多细胞因子诱导分化为软骨。采用基因转染技术观察转化生长因子β2对体外培养的骨髓间质前体细胞向软骨分化的影响。 方法：实验于2005-12/2007-01在中日友好医院临床研究所骨科实验室完成。①骨髓标本来源于6名志愿者，对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。②实验方法：志愿者局麻下行骨髓穿刺，抽取7.0~10.0 mL骨髓抗凝，以密度梯度离心法分离人骨髓间质前体细胞，通过脂质体介导转染技术，将pcDNA3.1(+)TGF-β2载体导入骨髓间质前体细胞中，体外单层培养。③实验评估：利用RT-PCR、Western Blotting和免疫组化法检测转化生长因子β2和软骨相关基因、蛋白的表达情况。 结果：①转染后48 h，可检测到明显的转化生长因子β2 mRNA表达，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA均有轻微表达；转染后4周，转化生长因子β2 mRNA表达稍有降低，Ⅱ型胶原A1和Aggrecan mRNA表达均明显上调。②转染后48 h和4周，间质前体细胞培养上清液中均有转化生长因子β2蛋白的表达。③转染后48 h部分细胞显示Ⅱ型胶原蛋白免疫组化阳性信号，转染后4周Ⅱ型胶原蛋白阳性细胞数增加。 结论：pcDNA3.1(+)/TGF-β2真核表达载体在骨髓间质前体细胞内可获得短暂和长期表达。在单层培养的情况下，骨髓间质前体细胞可被转化生长因子β2诱导向软骨方向分化。     

SOX-9和胰岛素样生长因子1共同转染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：单基因诱导虽能对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化产生积极影响,但作用有限,多种基因共同作用才符合机体真实内环境的需求,并有助于发挥多基因产物之间的协同作用,提高分化效果。 目的：验证应用SOX-9和胰岛素样生长因子1基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果。 设计、时间及地点：两样本观察,实验于2008-04/2009-02在中国医科大学细胞生物实验室完成。 对象：6周龄健康雄性Wistar大鼠2只用于骨髓间充质干细胞提取。 方法：扩增、提取质粒pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠骨髓间充质干细胞。按转染情况分为5 组：①未转染组：仅加入双无(无血清无双抗)L-DMEM。②转染空载体组：双无L-DMEM +pcDNA3.1空载体和脂质体。③转染SOX-9组：双无L-DMEM+pcDNA3.1- SOX-9质粒和脂质体。④转染胰岛素样生长因子1组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1质粒和脂质体。⑤共转染组：双无L-DMEM分别+pcDNA3.1-IGF-1、pcDNA3.1-SOX-9质粒和脂质体,混合。 主要观察指标：对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,反转录-聚合酶链反应和Western blot法检测筛选后细胞目的基因和蛋白的表达。 结果：MTT法检测转染SOX-9组、转染胰岛素样生长因子1组和共转染组骨髓间充质干细胞增殖活性A值显著高于未转染组、转染空载体组(P < 0 01)。反转录-聚合酶链反应和Western blot检测目结果显示,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;胰岛素样生长因子1表达以共转染组最多;软骨细胞特异性基质Ⅱ型胶原表达以共转染组最多。 结论：双基因转染在诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞转化的能力和细胞外基质分泌的能力上更明显高于单基质转染;另外结果间接说明胰岛素样生长因子1具有诱导骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的作用,但能力弱于SOX-9。     

pEGFP-C2基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究

目的探讨以最近发展起来的核转染技术直接将编码绿色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞的细胞核内进行基因修饰的可行性。方法从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞。以NucleofectorTM技术转染pEGFP-C2(EGFP组),以同期培养未转染的细胞作为对照组。测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率。结果在转染后24h成功发现EGFP的表达。两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线。EGFP的表达逐渐增强,至第6天达到最高峰(47.8%),观察一个月未发现表达减弱。结论pEGFP-C2基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响;EGFP可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记;NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法。