P16基因重组质粒的构建及其对人脑胶质瘤细胞的抑制作用

目的：探讨P16基因对人胶质瘤细胞的抑制作用,为胶质瘤致瘤机理的研究和基因治疗提供理论基础。方法：运用分子克隆技术构建重组人P16基因功体（pcDNA3-P16),通过脂质体介导法将P16cDNA转染到存在P16基因纯合缺失的人胶质瘤细胞系SHG－44。结果：PCR证实含P16cDNA质粒DNA已转入SHG－44细胞,Western blot显示有P16蛋白表达。细胞生长曲线显示转杂P16基因的SHG－44细胞（SHG－44－P16）生长明显受到抑制,基抑制率达84．27％。在软琼脂上克隆形成能力下降约6倍。细胞周期分析表明,处在G1期细胞由30．70％提高到66．21％。结论：野生型P16基因导入P16基因功能缺失的肿瘤细胞,能恢复其抑制肿瘤细胞生长的功能。     

外源性p21WAF1/CIP1基因转染对人胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响

目的：探讨外源性p21^WAF1／CIP1基因对胶质瘤细胞生长和细胞周期的影响．方法：采用脂质体介导法将p21^WAF1／CIP1基因质粒转导人人胶质瘤细胞系SHG44细胞，然后用电镜、流式细胞仪等技术对细胞形态、生长及细胞周期进行观察。结果：酶切电泳和斑点杂交显示p21^WAF1／CIP1基因成功的转染至SHG44细胞。转染p21^WAF1／CIP1基因的细胞光镜及电镜下可见凋亡产生；生长速度明显慢于亲代细胞，其倍增时间约是对照细胞的二倍；细胞周期发生明显改变，G1期明显增多，S期明显减少．结论：外源性p21^WAF1／CIP1基因对SHG44细胞的生长和细胞周期有明显的抑制作用，并可诱导细胞凋亡产生。     

去甲二氢愈创木酸对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5生长的影响

目的观察去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)对人恶性胶质瘤细胞系CHG-5体内外生长的影响.方法采用MTT法、流式细胞仪、光镜等技术观察CHG-5细胞体外增殖、细胞周期、凋亡和裸鼠移植瘤生长情况.结果NDGA可显著抑制CHG-5细胞体外增殖,G0/G1期细胞明显增多,S、G2/M期细胞减少,凋亡细胞增加.采用接种后第5天按50 mg/kg腹腔内注射给药,治疗组移植瘤体积较对照组缩小,未见明显的毒副作用.结论NDGA对CHG-5细胞的体内外生长具有一定的抑制作用,其作用可能与细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡有关.     

芳香化酶对胶质瘤细胞系SHG-44细胞生长及分化的作用

目的 在人胶质母细胞瘤细胞系SHG－44细胞中检测到芳香化酶细胞色素P450（AROM）表达的基础上探讨AROM对胶质瘤细胞生长增殖及分化的作用。方法 通过构建反义AROM真核表达载体，转染SHG－44细胞，利用流式细胞仪、MTT法、免疫荧光染色及激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）等技术观察封闭AROM基因表达后细胞生长曲线、细胞周期及中间丝蛋白GFAP和Vimentin表达的变化。结果 成功构建了反义AROM真核表达载体PCI／as-AROM并使AROM的表达封闭达50％以上。SHG－44细胞在转 染了PCI／as-AROM和空载体PCI－neo后，生长曲线、细胞周期无明显变化，但GFAP免疫荧光强度减弱而Vimentin免疫荧光强度增强。结论 反光AROM可能对SHG－44细胞增殖无明显影响但对神经胶质瘤细胞的分化有一定的抑制作用。     

PTEN基因诱导人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡及bcl-2表达下调

目的 探讨PTEN基因对人脑胶质瘤SHG－44细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响，阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法PTEN基因体外转染SHG－44细胞，筛选阳性细胞克隆，以原位杂、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况；采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞的凋亡情况；以免疫荧光法检测bcl-2基因的表达。结果 PTEN基因转染的SHG－44细胞有PTEN蛋白的表达。透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞质浓缩、核破裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现；流式细胞仪显示细胞周期从G1期到S期发生抑制，并且在G1期峰前出现一明显的凋亡峰（15．9％）；细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带；bcl-2的表达也显著下调。结论 PTEN基因可诱导SHG－44细胞凋亡，并下调bcl-2蛋白的表达，这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制之一。     

CDK4在去甲二氢愈创木酸抑制恶性胶质瘤细胞增殖中的作用

目的：探讨细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶4（CDK4）在去甲二氢愈创木酸（NDGA）抑制人恶性胶质瘤细胞系SHG－44细胞增殖中的作用。方法：采用细胞培养、细胞计数、流式细胞仪检测、免疫沉淀、免疫组化及图像分析等技术方法。结果：①在10－200μmol/L浓度范围内,NDGA可使SHG－44细胞增殖受阻,且NDGA液浓度越高,这种作用越明显,即呈明显的剂量依赖性;②NDGA对细胞周期抑制作用主要表现于G1→期;③NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4蛋白激酶的活性降低,且这种作用与NDGA的处理浓度呈正相关,与NDGA对SHG－44细胞的增殖抑制作用相一致;④NDGA处理后,SHG－44细胞CDK4基因的蛋白表达明显减弱。结论：CDK4蛋白激酶活性降低在NDGA抑制SHG－44细胞增殖中起着十分重要的作用。     

芦荟大黄素对体外胶质瘤细胞生物学行为的影响

目的:探讨芦荟大黄素(Aloe emodin,AE)在体外对胶质瘤SHG44细胞增殖、细胞周期、黏附、迁移和侵袭能力的影响。方法:将体外人脑胶质瘤细胞分为两组,实验组经AE处理(AE浓度分别为20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L),同时设对照组(未经药物处理)。采用CCK-8法检测AE处理后SHG44细胞的增殖情况;流式细胞仪分析细胞周期变化;细胞黏附实验检测细胞黏附能力,通过Transwell小室方法检测AE对SHG44细胞迁移和侵袭能力的影响。结果:与对照组相比,AE处理胶质瘤SHG44细胞后,CCK-8法及流式细胞仪分析结果显示AE能抑制SHG44细胞增殖,并呈剂量依赖和时间依赖效应关系;对于细胞周期的影响主要变现为引起细胞发生S期阻滞;AE处理后能降低SHG44细胞的粘附能力;Transwell小室实验表明AE处理后的SHG44细胞迁移和侵袭能力明显降低。结论:AE能通过阻滞细胞周期于S期而抑制胶质瘤SHG44细胞的增殖,并且下调胶质瘤细胞的黏附能力,降低细胞体外迁移及侵袭能力。     

反义c-myc重组腺病毒对人肝细胞癌细胞的实验性治疗

目的：研究携带反义c-myc的重组腺毒（Ad-Asmyc)对人肝细胞癌细胞体外,体内的治疗作用及其机制,方法：用Ad-Asmyc感染人肝细胞癌细胞系BEL－7402和QSG－7701,绘制细胞生长曲线,进行克隆形成实验,研究Ad-Asmyc在体外的抗瘤作用,在瘤内注射Ad-Asmyc,观察裸鼠皮下移植的生长情况,应用逆转聚合酶链反应（RT－PCR）及Western blot检测相关基因表达,应用流式细胞术,梯形DNA,DNA原位末端标记研究细胞周期及细胞凋亡情况,结果：感染Ad-Asmyc后,BEL－7402及PSG－7701细胞内c-myc基因表达降低,肿瘤细胞的生长受到明显抑制,而且出现了G1期阻滞及凋亡,体内注射Ad-Asmyc基因表达降低,肿瘤细胞的和长受到明显抑制,而且出现了G1期阻滞及凋亡,体内注射Ad-Asmyc后裸鼠皮下移植的生长也得到明显掏,结论：Ad-Asmyc在体外及体内可使肝细胞癌出现的细胞生长抑制,发生凋亡,具有明显的抗癌作用,是有应用前景的抗癌药物。     

雷公藤单体对胶质瘤细胞体外抑制作用的实验研究

目的：研究雷公藤单体对胶质瘤细胞的体外抑制作用。方法：MTT法测定3种雷公藤单体对胶质瘤细胞株SHG44、C6、U251的体外抑制作用；免疫组化法观察雷公藤甲素与雷公藤红素对SHG44胶质瘤细胞bax,bcl-2蛋白表达的变化。结果：雷公藤二萜类单体雷公藤甲素对胶质瘤细胞有极明显的抑制作用；雷公藤三萜类单体雷公藤红素的抑制作用次之。两者均使SHG44细胞bax表达增加，bcl-2表达下降。结论：雷公藤甲素与雷公藤红素对胶质瘤细胞有明显的抗肿瘤作用，其作用与促进bax表达，抑制bcl-2表达，促进细胞凋亡有关。     

苯丁酸钠对体外培养人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用

目的：探讨苯丁酸钠（SPB）在体外诱导人宫颈癌Hela细胞生长抑制、分化和细胞周期阻滞。方法：培养Hela细胞,应用MTT比色法观察苯丁酸钠对Hela细胞的生长抑制作用,倒置相差显微镜观察细胞形态改变,流式细胞术分析细胞周期。结果：苯丁酸钠可明显抑制Hela细胞的生长,呈时间-剂量依赖性,并出现典型的细胞形态学改变;苯丁酸钠诱导Hela细胞阻滞于G0／G1期,s期细胞数减少。结论：苯丁酸钠在体外抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖,使阻滞于G0／G1期。这可能是苯丁酸钠抗宫颈癌作用的重要机制之一。     

TNP-470对肺腺癌细胞诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其与Flk-1表达的关系

目的：探讨TNP-470对肿瘤细胞诱导的血管内皮细胞增殖和凋亡的影响及其与血管内皮生长因子(VEGF)受体酪氨酸激酶受体（Flk-1）的关系。方法：培养肺腺癌AGZY-82A细胞株，并制备条件培养液，加入培养的血管内皮细胞，用免疫组化S-P法检测TNP-470对癌细胞诱导后内皮细胞增殖细胞核抗原（PCNA）、p53和VEGF受体Flk-1表达的影响。结果：TNP-470能抑制癌细胞诱导的内皮细胞表达PCNA，当TNP-470的浓度达10^3ng/ml，细胞增殖几乎停止；而凋亡相关基因蛋白p53的表达逐渐增加；并且TNP-470以剂量依赖方式抑制内皮细胞Flk-1的表达，当TNP-470浓度达10^4ng/ml时，Flk-1的表达几乎完全受到抑制。结论：TNP-470可以通过阻止肿瘤细胞诱导的内皮细胞表达VEGF受体，抑制内此细胞的增殖，促进其凋亡，而达到体内抑制肿瘤生长和转移的作用。     

TNP-470对人肝癌细胞增殖和凋亡的实验研究

目的:研究TNP-470对肝癌细胞(SMMC-7721)的增殖抑制效应和凋亡诱导作用。方法:采用四氮唑盐还原法(MTT)检测药物对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用。琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯状条带,流式细胞仪检测细胞凋亡峰和细胞周期变化。结果:MMT法显示TNP-470可显著抑制SMMC-7721细胞体外增殖,DNA电泳显示典型的梯状条带,流式细胞仪检查有明显的凋亡峰出现,细胞周期阻滞在G2/M期,实验用药组细胞凋亡率明显增高,与对照组存在显著性差异(P<0.01)。结论:TNP-470对SMMC-7721体外直接杀伤作用不明显,但可诱导SMMC-7721细胞体外凋亡,诱导凋亡可能是其抗肿瘤作用机制之一。     

碘-125对胶质瘤SHG-44细胞的细胞程序性死亡作用及相关基因表达的影响

目的：观察碘-125（125I）粒子对体外培养的人脑恶性胶质瘤细胞系SHG-44的生长抑制及诱导细胞程序性死亡作用,阐明此过程中相关基因的作用机制。方法：人脑恶性胶质瘤细胞株SHG-44,根据应用125I粒子剂量不同分为对照组与处理组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测125I粒子对SHG-44细胞增殖率的影响;用电镜和原位凋亡检测法(TUNEL)及流式细胞仪、吖啶噔／溴乙啶双荧光染色检测细胞程序性死亡改变,应用基因芯片技术筛选出处理前后与细胞程序性死亡有关的表达差异有统计学意义的基因。结果：125I粒子作用于体外培养的SHG-44胶质瘤细胞,产生了剂量、时间依赖性的增殖抑制作用。MTT比色法检测,经125I粒子处理的SHG-44人胶质瘤细胞,随放射剂量的增加和作用时间的延长,A值明显降低。经2粒125I粒子作用3 d（累积剂量86.8 MBq）抑制率约为50%,与对照组比较差异有显著性（P<0.05）。透射电镜下观察到处理后SHG44胶质瘤细胞中频繁细胞自噬现象。流式细胞仪检测,S期细胞数在作用后逐渐减少,而G1期和 G2/M期细胞比例显著增加。虽然细胞中凋亡细胞的比例随时间的延长有所增加,但比例未超过2％。筛选出SHG-44胶质瘤细胞在125I粒子作用前后差异表达且与程序性死亡相关的基因共56条(上调 36条,下调20条)。结论：125I粒子以剂量、时间依赖性方式通过细胞程序性死亡来抑制胶质瘤细胞的增殖,促进细胞向凋亡方向转化;125I粒子诱导下的细胞系中还存在非凋亡调控的细胞程序性死亡(自噬);胶质瘤细胞凋亡过程中相关基因p53/ATM通路的基因、c-myc家族、p16、Bcl-2家族等参与诱导胶质瘤细胞程序性死亡的发生机制。     

5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸对人脑胶质瘤SHG-44细胞增殖的作用及其机制

目的：探讨氯通道阻断剂5-硝基-2-(3-苯丙胺)苯甲酸（NPPB）对人脑胶质瘤SHG-44细胞生长的影响,初步阐明NPPB抑制胶质瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的可能机制。方法：培养人脑胶质瘤SHG-44细胞,将其分为空白对照组和50、100及200  μmol•L^-1 NPPB组,MTT法检测各组SHG-44细胞的增殖活性,细胞分析仪分析细胞周期变化及凋亡率。结果：MTT检测,与空白对照组比较,50   μmol•L^-1 NPPB 组在48 h时细胞增殖活性降低（P<0.05）,200  μmol•L^-1 NPPB组3 h时细胞增殖活性增高（P<0.05）,100和200   μmol•L^-1 NPPB组24和48 h时细胞增殖活性明显降低（P<0.01）。细胞周期检测,与空白对照组比较,50  μmol•L^-1 NPPB组G1期细胞百分数明显减少,G2/M期细胞百分数明显增多（P<0.01）,100和200  μmol•L^-1 NPPB组细胞增殖停滞在G1期（P<0.01）。细胞凋亡检测,与空白对照组比较,100和200  μmol•L^-1 NPPB组细胞凋亡率明显升高,分别达到24.64%和41.85%（P<0.01）。结论：高浓度NPPB可以抑制人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖并诱导其凋亡,提示氯通道在人脑胶质瘤SHG-44细胞的增殖与凋亡中起一定的作用。     

TNP—470对大鼠血管平滑肌细胞生长的抑制作用及细胞周期的影响

OBJECTIVE: To study the effect of TNP-470 on the growth and cell cycle of vascular smooth muscle cells (VSMCs) in rats. METHODS: MTT assay was employed to observe the growth inhibition of the VSMCs from rat thoracic aorta cultured in vitro by TNP-470, and the effect of TNP-470 on the cell cycle and expressions of cyclin D1, CDK4 and p27 in the VSMCs were examined by flow cytometry. RESULTS: TNP-470 exhibited inhibiting effect on the growth of VSMCs in vitro, with the IC(50) value of 23.3 g/L. The cell ratios of the VSMCs at S phase and G(2)/M phase were significantly decreased to (15.43+/-5.16)% and (9.49+/-2.70)% respectively in response to TNP-470 treatment from the control levels of (22.29+/-6.80)% (P<0.05) and (16.51+/-8.61)% (P<0.05), and G(0)/G(1)-phase cell ratio significantly increased to (75.14+/-6.62)% from (60.38+/-7.23)% (P<0.001). TNP-470 had resulted in significantly lowered proliferation indexes of the VSMCs, from 39.62+/-7.23 down to 23.76+/-7.92 (P<0.001). After TNP-470 treatment, the expression of cyclin D1 and CDK4 in the VSMCs were both significantly decreased (P<0.05) while p27 underwent contrary changes (P<0.001). CONCLUSION: TNP-470 executes its inhibiting effect on VSMC growth by way of halting the cell cycles, the mechanism of which may involve the expressions of cyclin D1, CDK4 and p27.     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

Study of apoptosis induced by nordihydroguaiaretic acid in human ma-lignant glioma cell line SHG-44

Objective: To investigate the effect and mechanism of nordihydroguaiaretic acid (NDGA) on apop-tosis in human malignant glioma cell line SHG-44. Methods: Cell growth inhibition was measured with MTT assay. Cell apoptosis was observed with light and electron microscopy and TUNEL. Expression of bcl-2 gene was measured with immunohistochemistry, in situ hybridization and image analyses. Results: NDGA at the concentration of 100 μmol/L inhibited the proliferation of SHG-44 cells and induced apoptosis in a time-de-pendent manner. The expression of Bcl-2 protein in SHG-44 cells was decreased in the present of 100 μmol/L NDGA along with the duration of treatment in a negative correlation with the degree of cell apoptosis. The bcl-2 mRNA expressed in SHG-44 cells was reduced after treatment with 100 μmol/L NDGA, apparently consistent with the immunohistochemical results. Conclusion.- NDGA can induce apoptosis of human malig-nant glioma cells probably by down-regulating expression of bcl-2 gene, though the exact mechanism needs further study.     

顺铂对鼠胶质瘤SHG-44细胞的增殖抑制和辐射增敏作用

目的:观察顺铂对鼠胶质瘤SHG-44细胞的抑制及放射增敏作用,并探讨其作用机制。方法:不同浓度紫杉醇(0、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml和5μg/ml)作用于SHG-44细胞,MTT法检测顺铂对SHG-44细胞的增殖抑制作用;克隆形成法检测细胞辐射敏感性变化,流式细胞术检测细胞凋亡百分率变化。结果:顺铂有明显的抑制SHG-44细胞增殖和提高其放射敏感性的作用,顺铂可提高3 Gy、6 Gy照射24 h后SHG-44细胞的凋亡率。结论:顺铂对人胶质瘤SH-44细胞具有杀伤及放射增敏作用。其可能机制是加强射线对肿瘤细胞的诱导凋亡效应,增加其杀伤肿瘤作用。