新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。     

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白去糖基化对体液免疫应答的影响

目的:观察乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原中蛋白(MHBs)中去糖基化对体液免疫应答的影响.方法:在MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/adr)基础上,通过PCR扩增基因修饰法,使MHBs上编码第4、59、146位氨基酸密码子基因由AAT/AAC突变为CAG,从而使AAT/AAC编码的天冬酰胺Asn(N)突变为CAG编码的谷氨酰胺Gln(Q),使得N-糖基化位点NXS、NXT突变为QXS、QXT.构建3株去糖基化核酸疫苗(dG1,去除Asn4处糖基化位点,位于preS2上;dG23,去除Asn59、Asn146处糖基化位点,均位于HBs上;dG123,去除Asn4、Asn59及Asn146位糖基化位点).脂质体法转染293T细胞,Western blot检测,观察它们在293T细胞中瞬时表达的差异;肌肉注射法免疫BALB/c小鼠,观察MHBs去糖基化对小鼠体液免疫应答的影响.结果:adr、dG23转染293T细胞后,在细胞内及上清液中均检测到HBsAg;dG1、dG123转染293T细胞后,在细胞内检测到HBsAg,但是上清液中未测到.adr、dG1及dG23免疫BALB/c小鼠后均产生抗-HBs抗体,最高滴度均达到1∶102 400;dG123几乎无抗体反应(＜1∶200).结论:Asn4去糖基化导致MHBs向细胞外的分泌障碍,但是对小鼠抗-HBs的产生无影响.Asn59、Asn146两处同时去糖基化对MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生影响轻微.Asn4、Asn59及Asn 146三处同时去糖基化明显影响MHBs的分泌和小鼠抗-HBs的产生.     

密码子优化的中国HIV-1流行亚型gp120共识序列核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

目的:构建能表达密码子优化的中国HIV-1流行亚型AE、Bc和B'gp120共识序列的核酸疫苗,并研究其免疫原性.方法:根据HIV-1的分子流行病学资料和包膜糖蛋白的氨基酸序列分析,设计了针对中国流行的AE,BC和B'(ThB)亚型的gp120共识序列.按哺乳动物细胞偏好的密码子对AE.BC和ThB 3个亚型的gp120共识序列分别进行密码子优化,合成优化基因.将密码子优化的gp120基因克隆到核酸疫苗载体pSW3891,构建重组质粒核酸疫苗.将重组质粒转染293T细胞,并以重组质粒疫苗免疫新西兰兔.应用蛋白质免疫印迹法检测转染细胞中gp120蛋白的表达.ELISA方法检测免疫后兔血清中gp120特异性抗体的产生.结果:3个密码子优化的gp120核酸疫苗,均能正确表达gp120.这些gp120核酸疫苗免疫家兔后,能产生HIV-1包膜糖蛋白特异性的抗体.结论:成功构建3个密码子优化的、表达HIV-1中国流行亚型AE,BC和ThB的共识序列的gp120核酸疫苗,能诱导HIV-1包膜蛋白特异的免疫反应.     

SFTSV糖蛋白Gn重组质粒的构建及其体液免疫原性研究

目的:研究严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)糖蛋白Gn的体液免疫原性?方法:将PCR方法扩增的SFTSV糖蛋白Gn基因和密码子优化后Gn基因克隆入载体pJW4303,构建Gn野生型和双优化重组质粒;经酶切和测序鉴定确认为目的质粒后,分别转染HEK293T细胞,Western blot检测糖蛋白Gn的表达;用Gn重组表达质粒及空载体分别免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体?结果:成功构建Gn重组野生型质粒pJW4303-WSP-Gn和双优化质粒pJW4303-tPA-Gn-opt;Western blot证实pJW4303-WSP-Gn编码Gn可在HEK293T细胞内表达,pJW4303-tPA-Gn-opt编码Gn在HEK293T细胞内表达并分泌到细胞外;ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性IgG抗体证实各重组质粒均能诱导特异性IgG抗体产生,双优化质粒较野生型质粒诱导产生的IgG时间更早?滴度更高?结论:SFTSV的糖蛋白Gn具有良好的免疫原性;和野生型质粒相比,双优化质粒更有利于糖蛋白Gn的表达和分泌,并且具有更好的体液免疫原性?     

表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫原性

目的:研究表达结核分枝杆菌ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗在小鼠体内诱导的体液和细胞免疫应答以及对结核分枝杆菌(MTB)感染小鼠的保护能力.方法:以100 μg重组质粒pcDNA-e6c10接种BALB/c小鼠腓前肌,共免疫3次. 末次免疫结束2 wk后,检测免疫小鼠特异性抗体滴度、淋巴细胞增殖指数、CTL杀伤效应以及诱导IFN-γ和IL-2水平. 另一部分免疫的BALB/c小鼠以1×105 MTB毒株H37Rv经尾静脉进行攻击,4 wk后计数脾脏细菌负荷数,观察免疫小鼠对MTB抵抗作用.结果:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1∶ 800. 淋巴细胞刺激增殖指数为2.42±0.13,显著高于生理盐水对照组;免疫小鼠诱导IFN-γ含量(2449±12)ng/L与卡介苗(BCG)组无明显差异,IL-2含量(198±16)ng/L不及BCG免疫组,但显著高于生理盐水对照组;同时融合蛋白诱导的CTL杀伤率为42%. 与生理盐水免疫组(细菌负荷6.51±0.13)相比较,DNA疫苗免疫的BALB/c小鼠对攻击感染后MTB在脾脏中增殖有较明显抵抗作用(细菌负荷4.51±0.23,P＜0.05),但与BCG免疫组相比脾脏细菌负荷无明显减少.结论:表达ESAT6-CFP10融合蛋白DNA疫苗能在结核病预防中有一定免疫治疗作用.     

融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导小鼠的免疫应答及其保护力

目的研究融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌诱导的小鼠体液和细胞免疫应答水平。方法以106CFU/0.1 mL重组M.S通过尾静脉途径免疫小鼠。用MTB培养上清滤液蛋白(CFP)作为抗原,用ELISA法测定免疫小鼠血清特异性抗体的滴度。取部分免疫小鼠脾淋巴细胞,体外用ESAT6-CFP10融合蛋白刺激后,以MTT比色法检测淋巴细胞增殖反应,同时检测免疫小鼠IFN-γ和IL-2水平及脾细胞杀伤效应。结果融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清特异性抗体的滴度为1∶6 400。淋巴细胞刺激增殖指数为2.8,明显高于生理盐水组(0.90);IFN-γ和IL-2的含量分别为2230±11 pg/mL和221±17 pg/mL,显著高于生理盐水对照组,但不及BCG免疫组;同时重组耻垢分枝杆菌诱导的脾细胞杀伤率为45%。结论融合表达ESAT6-CFP10蛋白的重组耻垢分枝杆菌能诱导小鼠产生特异性体液和细胞免疫应答,可作为结核新型疫苗使用。     

小鼠IFN-γ基因佐剂对分泌型柯萨奇病毒B3 VP1核酸疫苗免疫作用的影响

目的: 构建小鼠IFN-γ真核表达质粒,观察其对分泌型柯萨奇病毒B3(CVB3)核酸疫苗的影响. 方法: 以RT-PCR扩增小鼠IFN-γ基因,构建真核表达重组质粒pcDNA3/mIFN-γ,检测其在cos-7细胞内的表达;将分泌型pcDNA3/sVP1, pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ肌注免疫小鼠,每2 wk注射1次,共3次,每次免疫后13 d取血测血清抗体水平. 末次免疫后2 wk,以500 TCID50的CVB3腹腔内感染,观察小鼠的存活情况. 结果: 成功构建了pcDNA3/mIFN-γ并能有效表达;pcDNA3/sVP1组和pcDNA3/sVP1 pcDNA3/mIFN-γ组均能诱导小鼠产生中和抗体,抗体滴度随免疫次数的增加而提高,但两组小鼠抗体滴度和生存率无显著性差异;混合质粒注射组血清的病毒滴度明显低于pcDNA3/sVP1组,且心肌病理损伤明显减轻. 结论: IFN-γ作为基因佐剂,在一定程度上增强了分泌型 CVB3 VP1基因疫苗的免疫保护作用.     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

传染病学

一、病毒性肝炎近年来核酸疫苗作为一种能有效地刺激机体产生特异性免疫应答的全新免疫方法而备受关注。乙型肝炎病毒核心抗原 (ＨＢｃＡｇ)是细胞毒Ｔ细胞 (ＣＴＬ)识别和攻击被ＨＢＶ感染细胞的主要靶抗原。南京大学第一医院在观察到ＨＢｃＡｇ核酸疫苗具有良好的细胞和体液免疫原性的基础上 ,分别单用ＨＢｃＡｇ核酸疫苗和疫苗加免疫佐剂ＱＳ 2 1对ＢＡＬＢ/Ｃ和Ｃ5 7ＢＬ/ 6小鼠进行免疫[1] 。结果发现ＱＳ 2 1对ＨＢｃＡｇ核酸疫苗所诱导的小鼠特异性抗体及ＣＴＬ应答均有增强作用。为进一步观察该核酸疫苗对非人灵长类动物的免疫原性 …     

乙肝病毒核酸疫苗诱导BALB/c小鼠特异性免疫应答

目的 现察舍乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)preS2S基因的核酸疫苗免疫小鼠后的特异性免疫应答.方法 将BALB/c小鼠随机分为4组分别肌肉接种pCMV-S2S、乙肝表面抗原(HBsA8)、空载质粒(pCMV)及生理盐水(NS).免疫组织化学法检测接种局部组织preS2S抗原的表达,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体Anti-HBs.结果 pCMV-S2S组小鼠肌肉细胞中有较多量的preS2S蛋白表达,其它小鼠肌肉细胞中均未检出preS2S蛋白表达.pCMV-S2S组小鼠CTL活性为(32.10±1.93)%,明显高于各对照组(P＜0.05).pCMV-S2S组小鼠8周后Anti-HBs阳性率最高为42.9%.HBsAg组小鼠4周时Anti-HBs阳性率即达到100%.pCMV组及NS组小鼠血清中均未检测出Anti-HBs.结论 乙肝核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内表达preS2S蛋白,并能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,也能诱生一定程度的特异性体液免疫应答.     

长春地区乙型肝炎病毒基因分型

目的：探讨长春地区慢性乙型肝病患者中乙型肝炎病毒（HBV）基因型特点。方法：慢性乙型肝病患者血清中提取HBV DNA,经巢式聚合酶链法(nested-PCR )扩增HBV S基因区片断,利用双脱氧链末端终止法检测HBV S区核苷酸序列并进行基因型分析。结果：39株HBV中C基因型23株,其中16株为C基因型adr亚型,7株为C基因型adw亚型;16株为B基因型adw亚型; 未发现ayr及ayw型;有2株存在“a”决定簇变异;与参照序列比较,S基因存在多处点突变,部分 点突变导致所编码的氨基酸变异;同以往研究的结果类似,未发现癌特异性的HBV S基因变异。结论：研究对象中HBV存在C基因型和B基因型, C基因型为主要基因型;HBV相关性慢性肝病患者中HBV S基因存在序列多态性。     

抗preS1分子高效单克隆抗体的制备及其在血清LHBs检测中的应用

目的 制备可用于血清LHBs检测的针对preS1高效单克隆抗体并进行初步临床应用研究.方法 对乙肝preS1区段基因(B基因型,adr血清亚型)全长序列(1～119 aa)进行密码子偏嗜性改造后,克隆入质粒pET32a构建原核表达重组质粒并转化入大肠杆菌BL21 (DE3),采用离子交换、HIS亲和层析柱以及肠激酶(E...     

人干细胞因子在大肠杆菌中的表达研究

目的 经过改造重组人干细胞因子（ｈｕｍａｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｃｔｏｒ,ｈＳＣＦ）,提高其表达量。方法 应用人工合成寡核苷酸引物及ＰＣＲ技术,改变人工干细胞因子ｈＳＣＦ ｃＤＮＡ起始密码子ＡＴＧ与ＳＤ序列之间的距离及在翻译起始区（即Ｎ端氨基酸）部分采用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）喜用型密码子的策略,使重组表达质粒ｐＢＶ２２０－ｈＳＣＦ在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得高效稳定表达。结果 ＤＮＡ序列测量证明基因     

人临床株幽门螺旋杆菌热休克蛋白A亚单位基因克隆及序列分析

目的获取人临床株幽门螺旋杆菌(Hp)热休克蛋白A(HspA)亚单位基因。方法用聚合酶链反应(PCR)技术从Hp的染色体DNA扩增HspA基因,将其定向插入pMD18-T克隆载体中进行核苷酸序列分析。结果经酶切鉴定及基因序列证实Hp HspA基因克隆成功。克隆载体pMD-HspA测序结果显示HspA DNA片段长度为357 bp。利用生物软件Om iga 2.0对临床分离的Hp和NCTC11637 HspA基因序列进行同源性比较,发现有14个核苷酸差异,基因序列同源性96.08%;对编码氨基酸进行比较,发现有1个氨基酸差异,氨基酸同源性99.15%。同时将Hp HspA序列与GenBank中公布的多株国外Hp HspA序列进行比较,结果显示基因序列同源性在95.20%~96.36%之间,氨基酸序列同源性在98.31%~100%之间。结论成功地获得人临床株Hp保守的HspA基因,为Hp HspA相关疫苗的研究奠定了实验基础。     

稳定表达HBsAg的P815细胞株的建立及鉴定

目的:筛选并建立稳定表达亚洲人常见的adr亚型HBsAg的P815细胞株,为乙肝DNA疫苗的效果评价提供体外细胞感染模型.方法:用PCR方法扩增乙肝病毒的S基因片段后装入pcDNA3载体,并通过脂质体转染P815细胞,G418筛选.结果:构建了重组质粒pcDNA3-HBsAg(S),转染细胞及其培养上清中均可检测到HBsAg(S)的存在,PCR扩增也证实HBsAg(S)基因已稳定整合于P815细胞的染色体中.结论:获得了稳定表达HBsAg的P815细胞株,为今后在小鼠体内检测乙肝DNA疫苗激发的CTL反应奠定了基础.     

我国人类免疫缺陷病毒-1主要流行株外膜蛋白基因V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸分析

目的鉴定我国HIV-1主要流行毒株亚型的env,V3-V4区及其临近区域的特征性氨基酸,并阐明其在追踪传染源和研究疫苗中的作用。方法应用nested—PCR对157份来自我国12个省份的HIV-1毒株env区序列进行扩增,并使用ABI377型测序仪测序,然后应用BLAST、GCG、MEGA和VESPA等生物学软件或程序对env基因V3-V4区及其临近区域序列进行基因型鉴定、系统树分析及特征性氨基酸鉴定。结果157份样本包括54份B′(34．40％)、61份B′／C(38．85％)和42份CRF01-AE(26．75％)毒株。系统树分析结果显示,B′亚型毒株序列均与B．CN．RL42十分接近,B′／C毒株主要与97CN54A和97CNGX6F聚成一簇。而CRF01—AE序列与THCM240和97CNGX2F聚在一起．而且分别聚成明显不同的两个亚组。特征性氨基酸分析发现,我国B′和B′／C毒株分别具有8个保守的特征性氨基酸,而且与代表株的相同位点氨基酸基本一致。而CRF01-AE重组毒株具有11个保守的特征性氨基酸,其中有9个位点与97CNGX2F和TH.CM240不一致。包括这9个特征性氨基酸的样本主要来自除云南省以外的其他省份。结论目前流行于我国的B′和B′／C毒株具有单一的共同传染源,而CRF01-AE毒株可能是通过不同输入源或不同传播途径先后从泰国传入我国的。这将对我国艾滋病防治策略的制定和正在进行的疫苗研究具有重要的指导意义。     

问号赖型钩端螺旋体内鞭毛蛋白与外膜蛋白基因融合DNA疫苗载体的构建

目的 为增强问号赖型钩端螺旋体（钩体017株）DNA疫苗内鞭毛蛋白基因（flaB2)与外膜抗原基因（ompL1)的免疫保护作用，构建一种能表达flaB2与omPL1蛋白融合蛋白的DNA疫苗载体。方法 通过聚合酶链反应分别扩增017钩体flaB2与ompL1片段并进行融合，获得的嵌合基因ompL1-flaB2中含有10个氨基酸的中间接头序列，以维持其空间构象，结果 经酶切鉴定，证实有一1.8kb片段插入载体，其flaB2及ompL1DNA测序结果与文献报道的一致。结论 表达017株钩体flaB2与ompL1抗原融合蛋白的DNA疫苗载体构建成功。     

杜氏盐藻2种碳酸酐酶基因跨内含子DNA序列的克隆和鉴定

目的：克隆杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶(DCA1)和碳酸酐酶(CA1)基因跨内含子基因组DNA序列。方法：利用跨内含子PCR方法,从杜氏盐藻基因组中克隆DCA1和CA1基因跨内含子基因组DNA序列。结果：DCA1基因跨内含子长度为4407bp,含7个外显子,由此推定的氨基酸序列长度为555个氨基酸残基;而CA1基因跨内含子长度为4473bp,含8个外显子,其推定的氨基酸序列长度为498个氨基酸残基。这2种基因的所有外显子一内含子交接点处序列都遵守GT—AG规律。结论：首次克隆得到了杜氏盐藻DCA1和CA1基因跨内含子DNA序列。     

A型流感病毒HA(H1N1)基因真核表达载体的构建及序列分析

[目的]构建A型流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因真核表达载体,研究其作为DNA疫苗的免疫效果。[方法]从流感病人体内分离流感病毒(A/Guangdong/376/2001/H1N1),提取RNA,用特异引物进行RT-PCR,扩增HA基因,先将其克隆到pMD18-T Vector,进行序列测定和分析;然后将HA基因亚克隆到真核表达载体(pCI-neo),进行鉴定。[结果]获得一个核苷酸长度为1698bp的基因,编码565个氨基酸;同源性比较结果表明:和A/Hong Kong/1131/98(GenBank/NCBI:AF386775)有98％同源,序列分析表明有10个氨基酸出现变异;酶切和序列测定表明HA基因正确插入pCI-neo载体(HA-pCIN)。[结论]HA基因真核表达载体的成功构建,可以进一步研究其免疫功能。