C3d增强基因免疫诱导的小鼠抗乙型肝炎病毒特异性免疫应答

目的探讨C3d对乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫诱导的特异性免疫应答的调节作用,为增强HBV基因疫苗免疫效果寻求新途径。方法将HBVpreS2/S编码基因分别插入真核表达载体TR421和含有三拷贝C3d编码基因的TR421C3d3质粒,构建重组质粒TR421preS2/S和TR421preS2/SC3d3。采用肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫,以空质粒TR421为对照,定期采集血清。ELISA法检测免疫小鼠血清特异性抗HBsIgG,3HTdR掺入法检测其特异性淋巴细胞增殖活性。结果TR421preS2/SC3d3重组质粒免疫组诱导的特异性抗HBsIgG水平明显高于TR421preS2/S重组质粒免疫组(P<005),而且TR421preS2/SC3d3重组质粒基因免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性也显著高于TR421preS2/S重组质粒组(P<005)。结论C3d可增强基因免疫诱导的HBV特异性体液和细胞免疫应答,为提高HBV基因疫苗的免疫效果提供了新的途径。     

HBV-DNA与乙肝病毒血清标志物及前S_1抗原相关性探讨

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)感染者血清中HBV-DNA与乙型肝炎病毒血清标志物(HBV-M)、前S1抗原(preS1-Ag)的相关性及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)法和酶联免疫吸附试验(ELISA)法在362例乙型肝炎患者血清中分别检测HBV-DNA、HBV-M、preS1-Ag,并对其结果进行对比分析。结果HBV-DNA阳性检出率与preS1-Ag阳性检出率比较无显著性差异(P>0.05),两者的阳性检出率均显著高于HBeAg的阳性检出率(P均<0.01)。结论定量检测HBV-DNA是衡量乙肝病毒复制有无及高低的最精确和最直接的证据,preS1-Ag较HBeAg更敏感更能反映体内的HBV感染和复制情况,联合检测HBV-DNA、preS1-Ag和HBeAg更有利于乙型肝炎的临床诊断、疗效观察和预后判断。     

慢乙肝治疗性疫苗IFN-γ-preS1表位分析及卡介苗重组穿梭质粒pMV261构建

目的 运用生物信息学方法分析预测乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的前S1(preS1)蛋白和重组IFN-γ-preS1蛋白的T、B细胞优势表位，构建卡介苗(Bacille calmette-guérin, BCG)重组pMV261穿梭质粒。方法 NCBI数据库中获取γ干扰素(Interferon γ,IFN-γ)和preS1的氨基酸序列，应用I-TASSER构建三级结构并对重组蛋白进行免疫模拟。利用SnapGene软件将重组IFN-γ-preS1蛋白全长基因插入大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261中，构建BCG重组pMV261。结果 preS1蛋白与重组IFN-γ-preS1蛋白分别由118和299个氨基酸组成。IFN-γ蛋白与特异性抗原preS1蛋白进行融合后，preS1蛋白的亲水性、稳定性均未发生改变，其二级结构和三级结构亦能正常表达。preS1蛋白经重组后，其B细胞抗原表位由preS1蛋白的4～18位、25～40位和41～59位氨基酸分别变为重组IFN-γ-preS1蛋白的185～199位、207～221和222～242位氨基酸，其余未发生改变；其T...     

乙型肝炎病毒基因疫苗诱导抗体的产生

乙型肝炎病毒(HBV) 基因疫苗可打破人群对HBV 表面抗原(HBsAg) 疫苗免疫无应答或低应答而产生保护性抗体,并有可能成为治疗HBV 持续性感染的特异性基因治疗剂。我们用构建的MS2 - preS表达质粒pMIP、IL- 2 - preS原核表达质粒pIIP、IL- 2- preS真核表达质粒pCWIIP分别经小鼠尾部皮下接种。实验结果显示3 种质粒均能诱导小鼠产生抗- preS抗体,且pIIP与pCWIIP产生抗体量高于pMIP(SAS统计分析,P< 0 .01) ,这说明IL- 2 - preS基因疫苗在体内可能有多种生物学功能,同时产生协同作用。pCWIIP产生抗体量略高于pIIP(SAS统计分析,p > 0.05)     

HBV-DNA定量与HBV血清学标志物的相关性探讨

目的 探讨HBV-DNA定量与HBV血清学标志物(HBV-M)的相关性.方法 采用实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测449例乙肝感染者血清的HBV-DNA含量,并用酶联免疫吸附试验(ELISA)对其血清学标志物进行检测.结果 在不同HBV-M模式中,HBV-DNA与preS1总检出率无显著差异.在模式HBsAg(+)、HBeAg(+)和HBcAb(+)中血清HB-DNA含量明显高于其他模式.在278例HBV-DNA阳性的标本中,HBV-DNA与preS1检出率无显著差异(P>0.05),HBV-DNA与HBeAg检出率有显著差异(P<0.01),同时preS1阳性组HBV-DNA定量值显著高于preS1阴性组.结论 HBV-DNA或preS1与HBV复制密切相关,preS1较HBeAg更能敏感反映HBV在体内的复制状况,联合检测HBV-DNA与HBV血清学标志物,在乙型肝炎的诊断治疗中更有重要的临床指导价值.     

乙型肝炎病毒前S1蛋白与病毒复制的关系

目的:探讨乙型肝炎病毒前S1蛋白(preS1)与乙型肝炎病毒血清标志物(HBV-M)以及HBV-DNA关系,了解preS1在乙肝感染及肝炎病毒复制中应用价值.方法:应用ELISA法检测424例preS1和HBV-M;应用荧光定量PCR检测176例HBV-DNA.结果:424例中有286例preS1阳性,阳性率为84%,并且preS1阳性只存在于HB-sAg( )HBeAg( )HBcAb( )(大三阳)、HBsAg( )HBeAb( )HBcAb( )(小三阳)、HBsAg( )HBcAb( )(小二阳)三种血清模式中,阳性率分别为96.1%、67.9%、82.8%,经x2检验三者之间有显著性差异(P<0.01).在155例HBeAg( )标本中,preS1的检出率为96.1%;而在286例preS1的阳性标本中,HBeAg的检出率为52.1%.在HBV-DNA阳性82例中;前S1的阳性率为92.7%,乙肝DNA阴性组中前S1的阳性率为36.2%.结论:通过对preSI、HBeAg和HBV-DNA的检测分析证实了preS1作为判断HBV病毒感染和复制的指标比单纯用HBeAg和HBV-DNA定量更敏感、更确切、是一项很好的检测指标.     

乙型肝炎病毒前S2蛋白激活人酰基蛋白硫酯酶1启动子

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白（preS2）对人酰基蛋白硫酯酶1（APT1）启动子的作用。方法生物信息学方法确定人APT1启动子序列。PCR扩增人APT1启动子和HBV preS2基因,分别插入pGL3和pcDNA3．1（－）质粒构建人APT1启动子荧光素酶报告基因质粒 pGL3‐APT1和 HBV preS2真核表达质粒 pcDNA3．1（－）‐preS2。将 pGL3‐APT1和pcDNA3．1（－）‐preS2共转染人肝癌细胞系 HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价 preS2对人APT1基因启动子的作用。数据用独立样本 t检验分析。结果测序结果证实pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1与实验设计相符。pGL3‐APT1的荧光素酶活性是阳性对照质粒pGL3‐Control的荧光素酶活性的1．2倍（P＜0．01）。pcDNA3．1（－）‐preS2与pGL3‐APT1共转染HepG2细胞的荧光素酶活性为无preS2基因质粒pcDNA3．1（－）与pGL3‐APT1共转染 HepG2细胞荧光素酶活性的2．6倍（P＜0．01）。结论本研究克隆的人APT1启动子序列具有高启动子活性;HBV preS2可激活人APT1启动子。     

hIL2-preS融合基因免疫小鼠诱导体液免疫应答

目的 探讨HBV preS基因免疫和hIL-2与preS融合基因免疫诱导BALB／c小鼠体液免疫反应的规律。方法 将preS基因及hIL2-preS融合基因分别克隆入真核表达载体pCMV4,转染COS－7细胞,明确有目的基因表达后,将重组质粒注射BALB／c小鼠臀部肌肉;ELISA方法检测小鼠血清抗体。结果 pCMV4-preS接种组,3／7小鼠产生抗preS2抗体。pCMV4-hIL2-preS接种组有3／7小鼠产生抗hIL-2抗体,而未检测到抗preS2抗体。结论 pCMV4-preS可有效诱导小鼠产生抗体反应。hIL2-preS融合基因接种BALB／c小鼠时,可诱导产生抗hIL-2抗体。     

乙型肝炎病毒前S1抗原与乙肝两对半定量检测的对比分析及意义

目的 探讨乙肝病毒前S1抗原(preS1)与乙肝两对半结果的关系以及与乙型肝炎病毒的存在关系。方法 ELISA和微粒子酶联免疫分析技术(MEIA)分别检测327例患者的preS1和乙肝两对半。结果 在114例HBeAg阳性标本中preS1阳性98例，阳性率86．0％；79例HBeAg阴性而HBeAb阳性的标本中preS1阳性者37例，阳性率46．8％；在11例乙肝患者HBeAg和HBeAb均阴性的血清中preS1阳性的仪3例，阳性率27．3％。结论 血清preS1是HBV在体内复制的又一个可靠而有用的指标，与乙肝两对半联合检测，在乙肝诊断、治疗及疗效考核中将互为补充，更加完善。     

HBV preS2-S DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答

目的:构建HBV表面抗原preS2-S基因表达质粒,并探讨其在小鼠体内的表达及诱导体液免疫应答的能力.方法:采用PCR方法,以PBR322-HBV2.0(adr亚型)质粒DNA为模板获得HBV preS2-S基因,并将其重组进入pcDNA3.0表达载体中,转染7721细胞系进行稳定表达;以此重组质粒免疫小鼠,ELISA方法检测免疫小鼠抗HBs抗体浓度.结果:构建了HBV preS2-S基因的表达质粒pcDNAS2-S,该表达质粒可在7721细胞中稳定高效表达;免疫接种小鼠2周后抗HBs抗体浓度明显升高,接种后第4周布比卡因处理组小鼠抗HBs抗体的浓度达到峰值161.4 mIU/ml,布比卡因非处理组第5周抗HBs抗体的浓度可达133.7 mIU/ml.结论:所构建的pcDNAS2-S表达质粒能有效表达并诱导小鼠体液免疫应答.     

THE COEXPRESSION OF THE preS1（1—42） AND THE CORE （1—144） ANTIGEN OF HBV IN E.coli

Atpresent，thereareabout１０millionpatientsofchronichepatitisinChina，ofwhichmorethan６０％arepatientsofhepatitisB．Morethan２millionnewcasesoccureveryyear，ofwhichabout２０％arepatientsofhepatitisBand５％～１０％willdevelopchronichepatitisBsubsequently．     

乙型肝炎病毒前S1抗原（1—42）与核心抗原（1—144）在大肠？…

目的 希望通过融合表达乙型肝炎病毒前Ｓ１抗原（ｐｒｅＳ１Ａｇ）（１－４２）及核心抗原（ＨＢｅＡｇ）（１－１４４）提高预防性疫苗的细胞免疫活性,为开发ＨＢ治疗性疫苗探索一条有效途径。方法 采用ＰＣＲ法获得在ＨＢｅＡｇ（１－１４４）基因后连接ＰｒｅＳ１Ａｇ（１－４２）基因的融合基因,然后将其插入表达载体ｐＥＴ－１１ｄ中,在大肠杆菌中进行表达。结果 获得了ＨＢｅＡｇ（１－１４４）、ｐｒｅＳ１Ａｇ（１－４     

白细胞介素2—乙型肝炎病毒前S抗原融合蛋白的免疫原性研究

目的　为协同人白细胞介素（ＩＬ－２）与乙型肝炎（乙肝）病毒（ＨＢＶ）前Ｓ抗原的生物学功能，探索治疗慢性乙肝的特异性免疫药物。方法用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和基因重组技术构建了ＨＢＶ完整前Ｓ抗原和ＩＬ－２的嵌合基因，并在大肠杆菌中高效表达了ＩＬ－２－前Ｓ抗原融合蛋白。结果该融合蛋白保留了ＩＬ－２和前Ｓ抗原天然分子的生物学活性，能维持白细胞介素２依赖株细胞增殖，其比活性约１０~７Ｕ／ｍｇ蛋白。该融合蛋白能与前Ｓ１和前Ｓ２单克隆抗体结合及与多聚人血清白蛋白（ＰＨＳＡ）结合，说明其具有相应抗原表位及受体。其诱导Ｂａｌｂ／ｃ小鼠产生抗前Ｓ抗体的效价分别是单独的前５抗原、前Ｓ抗原与ＩＬ－２的混合物及ＭＳ－２－前Ｓ融合分子的１３、９和１１倍多。结论ＩＬ－２．前Ｓ抗原融合蛋白能增强前Ｓ抗原的免疫原性，促进机体的免疫应答；另外，ＩＬ－２－前Ｓ抗原融合蛋白在人体内具有双重导向作用，可能成为新一代慢性乙肝和肝癌的免疫治疗剂。     

EFFECTS OF HBV preS AS A HUMORAL ENHANCER ON THE ABILITIES OF HCV E2 PROTEIN TO INDUCE IMMUNE RESPONSESIN THE DNA-IMMUNIZED MICE

Objective. To study whether the abilities of hepatitis C virus (HCV) E2 gene immunization to induce humoral and cellular immune responses to E2 protein were affected by hepatitis B virus (HBV) preS gene when they were fused in DNA-immunized mice.Methods. Mice were immunized with E2, preS-E2(preS gene was upstream of E2 gene), and E2 - preS (preS gene was downstream of E2 gene)gene by their eukaryotic expression vectors, respectively. The anti - E2 or anti - preS antibodies were detected using the E2 and preS antigens. The cellular immune response to E2 protein in immunized mice was presented by its survival time after injecting SP2/O myeloma cells expressing HCV E2 protein into the abdominal cavity.Results. Chimeric E2 and preS gene immunization can induce mice to develop anti-preS and anti-E2 antibodies. The number of the mice developing anti-E2 antibody and the antibody titers in preS-E2 gene-injected group were higher than those in E2-preS gene-immunized group. However, the mice injected with E2 gene     

HCV E2和HBV preS融合蛋白真核表达载体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)E2和乙型肝炎病毒(HBV)preS融合蛋白的真核表达载体.方法:用PCR方法扩增HBV preS和HCV E2蛋白基因,并将二者克隆到真核表达载体pcDNA3中,用脂质体转染试剂将其转入COS7细胞,通过免疫荧光检测细胞瞬时表达的融合蛋白.结果:E2-preS融合蛋白基因包括了全长的HBV preS和HCV E2蛋白基因,嵌合基因长度约1.6 kb.表达载体在COS7细胞表达出了E2-preS融合蛋白.结论:构建的E2-preS融合蛋白表达载体能在哺乳动物细胞中表达融合蛋白,为获得真核表达的融合蛋白及研究此蛋白的免疫原性打下基础.     

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究

目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。 结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。     

中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者病毒基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性

目的 研究不同民族慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV前S2／S（preS2／S）和C（core,C）基因在大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）中表达的稳定性和水平,并对其抗原性进行鉴定,为创制新型疫苗提供抗原材料。方法从中国云南少数民族地区50例慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV基因组DNA,将聚合酶链反应（PCR）扩增-克隆-测序的HBV preS2／S和C基因插入到表达载体pkPR上,构建重组pkPR-S2S和pkPR-C表达质粒,并在大肠杆菌TOP10中表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定表达产物非融合蛋白,并对其抗原性用Western印迹和ELISA方法进行检测。结果SDS-PAGE检测到全部慢性乙型肝炎患者pkPR-S2S和pkPR-C重组质粒在大肠杆菌TOP10中存在稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白相对分子质量分别为31000和21000,非融合蛋白浓度约占16％,纯度达96％。Western印迹和ELISA分析,非融合蛋白能分别与HBVpreS2／S抗原单抗、C抗原单抗及慢性乙型肝炎患者血清发生反应,而与对照的甲型肝炎（HAV）患者血清、丙型肝炎（HCV）患者血清及正常血清之间无交叉反应。结论中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者HBV preS2／S和C基因在大肠杆菌TOP10中有稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白具有抗原性。这些发现为创制新型疫苗具有潜在应用价值。     

Soluble expression of active human β-defensin-3 in Escherichia coli and its effects on the growth of host cells

Background Human β-defensin-3 （HBD3） is an epithelial peptide that has been demonstrated to have a salt-insensitive broad spectrum of potent antimicrobial activity. Expressing antimicrobial peptides in Escherichia coil （E. colt） is very difficult for it can result in death of the bacterial host cells. Our aim was to establish a prokaryotic system expressing soluble HBD3 protein and demonstrate the antimicrobial activity of the expressed protein. We then studied whether the host cells would activate the suicide pathways. Methods We first cloned the complementary DNA coding for the mature chain of HBD3, inserted it into the vector PGEX-KG then transformed E. coil BL21 （DE3） with the appropriate recombinant plasmid. After induction with 0.5 mmol/L isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside （IPTG） the transformed E. cofiproduced a recombinant glutathione S-transferase and HBD3 （GST-HBD3） fusion protein. The fusion protein was treated with thrombin to produce pure HBD3 protein then the antimicrobial activity of HBD3 was evaluated in a liquid microdilution assay. Results The fusion protein GST-HBD3 was efficiently cleaved by thrombin and yielded HBD3 that had anti-staphylococcus aureus activity with a minimal inhibitory concentration level of 12.5 μg/ml. The E. coil strain expressing the recombinant protein did not grow slower than the empty vector strain. Conclusion Active HBD3 in E. coil by expressing the recombinant protein GST-HBD3 could be produced, and suicide did not occur in the E. coli strain expressing the recombinant protein.     

酿酒酵母无机焦磷酸酶基因在大肠杆菌中的表达及其意义

目的：利用大肠杆菌表达酿酒酵母无机焦磷酸酶(Y-IPPA),获得具有活性的酿酒Y-IPPA。方法:以酿酒酵母基因组为模版,通过查询NCBI获得酿酒酵母无机焦磷酸酶序列,设计引物,用PCR方法获得酿酒Y-IPPA基因序列,插入克隆性载体pMD19-T Simple Vector中,并转化至大肠杆菌DH5α扩增,获得重组质粒,经酶切及测序验证正确后,将酶切的目的片段插入到原核表达载体p ET28(a)中,再转化大肠杆菌DH5α扩增,经酶切及测序验证正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达蛋白,通过IPTG诱导表达出Y-IPPA,以金属离子亲和层析蛋白纯化系统纯化蛋白,并测定其比活和酶学性质。结果：获得与pMD19-T Simple Vector一致的Y-IPPA碱基序列,构建了重组表达质粒pET28(a)-Y-IPPA,并转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导并进行SDS-PAGE电泳,在相对分子质量为32 000处可见Y-IPPA蛋白条带;镍柱亲和层析纯化目的蛋白,其中一组的蛋白浓度、活性和比活分别为0.312 g.L^-1、31.13 units.mL^-1和99.73 uints.mg^-1。结论:成功制备Y-IPPA蛋白,为进一步研究其酶学性质奠定了基础。     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。