BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达

目的：克隆骨形态发生蛋白BMP7基因并检测其在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达。方法：从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中提取总RNA;按GenBank BMP7基因序列化学合成2条引物,采用RT-PCR方法得到BMP7基因;将BMP7基因片段插入到真核表达载体pcDNA 3.1中,构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒;利用双酶切、PCR及核苷酸序列分析鉴定BMP7目的基因;将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒转染家兔关节软骨细胞,分别采用原位杂交、PCR、Western blotting法测定BMP-7表达。结果：克隆得到的BMP7基因核苷酸序列长约1 300 bp,构建的重组pcDNA 3.1-BMP7真核表达载体质粒目的基因BMP-7序列与GenBank报道的BMP-7基因（No. BC008584)一致,转染了BMP7基因的体外培养的成年家兔膝关节软骨细胞表达了BMP7蛋白。结论：成功构建表达BMP7蛋白的转基因关节软骨细胞,其可用于细胞移植治疗或作为种子细胞构建组织工程软骨修复关节软骨缺损。     

HO-1基因真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1的构建及表达

目的:构建人HO-1真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1并检测其表达。方法:利用分子生物学技术,将hHO-1基因与质粒pcDNA3.1连接,构成重组质粒并用RT-PCR及Western blotting方法检测重组载体在Eca-9706细胞中的表达情况,最终确定重组载体是否构建成功。结果:用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,RT-PCR检测,Western blotting检测证明hHO-1成功克隆入表达载体pcDNA3.1中。结论:本部分实验成功构建了能够在细胞内大量表达HO-1基因产物的真核表达载体pcDNA3.1-hHO-1,为进一步实验奠定基础。     

NOV基因真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的表达

目的获得NOV基因真核表达载体并检测其在细胞中的表达.方法利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,从新鲜大鼠大脑组织的总cDNA中扩增出1 165 bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切后定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中,用脂质体法将载体转染入COS-7细胞中,用Western blot和免疫细胞化学方法检测其表达情况.结果 NOV基因cDNA已经正确克隆到真核表达载体pcDNA3.1/Myc-His( )/lacZ质粒中;体外转染入COS-7细胞中后,可见转染细胞有NOV蛋白的表达.结论本实验所构建的重组质粒为NOV基因的作用研究提供了有利的分子工具.     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的 构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达.方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒.重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞.RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达.结果 成功构建了peDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达.结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础.     

人重组Oct3／4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株（SKOV3）,观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418（neomycin）筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量（10.225±0.987）显著高于转染对照组（1.713±0.896）和阴性对照组（校正值为1）（P＜0.01）.结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

人重组Oct3/4真核表达载体构建及在卵巢癌细胞中的表达研究

目的 构建人Oct3/4真核表达载体并转染人卵巢癌细胞株(SKOV3),观察Oct3/4在SKOV3稳定细胞株中的表达.方法 采用RT-PCR技术扩增获得目的 基因Oct3/4 cDNA产物,利用pcDNA3.1载体质粒构建人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,酶切及DNA测序鉴定.利用脂质体Lipofectamine 2000介导重组质粒转染SKOV3,以空载体转染细胞和未转染细胞作为转染对照组和阴性对照组.经G418(neomycin)筛选获得SKOV3稳定转染细胞株,Western blotting分析检测细胞Oct3/4蛋白的相对表达水平.结果 PCR扩增产物经12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定目的 基因条带大小约1 000 bp,与理论预期值一致.构建完成人重组Oct3/4真核表达载体pcDNA3.1-Oct3/4,DNA测序结果与GenBank数据库进行比对序列一致.Western blotting检测显示,转染pcDNA3.1-Oct3/4组稳定转染细胞中Oct3/4蛋白相对表达量(10.225±0.987)显著高于转染对照组(1.713±0.896)和阴性对照组(校正值为1)(P＜0.01).结论 成功构建人重组0ct3/4真核表达载体并转染SKOV3,稳定转染细胞株中Oct3/4蛋白呈稳定过量表达.实验为进一步研究Oct3/4基因在卵巢癌发生、发展及耐药机制中的作用奠定了基础.     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

携带FLAG标签的人BTG2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达 

目的：构建人B细胞易位基因2（BTG2）真核表达载体,并在HeLa细胞中表达携带FLAG标签的BTG2蛋白,为阐明BTG2基因的功能提供实验工具。方法：利用PCR法获得全长BTG2片段,将扩增得到的片段插入真核细胞表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆位点;然后按照FLAG序列设计并合成寡核苷酸片段,插入pcDNA3.1(+)-BTG2载体,构建pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2载体;将以上重组质粒转染HeLa细胞,将细胞分为转染pcDNA3.1(+)空载体组、转染pcDNA3.1(+)-BTG2组和转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组,采用抗FLAG抗体的Western blotting法,检测FLAG-BTG2融合蛋白在HeLa细胞中的表达水平。结果：将全长BTG2片段链接于pcDNA3.1(+)质粒,经限制性核酸内切酶BamH Ⅰ酶切分析及DNA测序证实载体序列准确;该载体转染HeLa细胞后用抗FLAG 抗体进行Western blotting法检测,在空载体组和pcDNA3.1(+)-BTG2组HeLa细胞中检测不到FLAG融合蛋白的表达,而在转染pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2组中检测到FLAG-BTG2融合蛋白的表达。结论：成功构建了pcDNA3.1(+)-FLAG-BTG2真核表达载体,并能在HeLa细胞中有效表达携带FLAG标签的BTG2蛋白。     

人骨形成蛋白2和7成熟肽编码区基因克隆和真核表达载体的构建

[摘要] 目的 克隆和构建人骨形成蛋白2和人骨形成蛋白7成熟肽真核表达载体。方法 采用Trizol法从人骨肉瘤细胞中提取制备总RNA,利用RT-PCR、PCR转录、扩增BMP-2和BMP-7获得成熟肽基因,与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,构建真核表达重组子pcDNA3.1(+)/BMP-2MP和pcDNA3.1(+)/BMP-7MP。结果 总RNA提取液电泳可见在28S、18S和5S处出现明显的条带,PCR和酶切可在439bp和364bp出现条带,阳性克隆测序结果与Genebank中登录的序列一致。结论 成功克隆出人BMP-2MP和BMP-7MP基因,成熟肽基因已与pcDNA3.1(+)连接,成功构建其真核表达重组子pcDNA3.1/BMP-2MP和pcDNA3.1/BMP-7MP,为进一步研究BMP-2、BMP-7的功能及其成熟肽基因在骨髓间充质细胞(hMSCs)中表达以及在骨组织工程中的应用研究奠定了基础。     

Smad2/3/4真核表达质粒的构建及重组蛋白表达

目的:构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内表达。方法:以pcDNA3.1-Smad2/3和pGEX2T-Smad4质粒为模板,设计特异性引物,PCR扩增Smad2/3/4全长编码基因,亚克隆至含有pcDNA3.1myc-HisA 标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚胎肾细胞HEK293 中,提取细胞蛋白进行 Western blotting 检测。结果：Smad2/3/4 全长基因序列克隆到真核表达载体pcDNA3.1myc-HisA中,酶切鉴定片段为1 401、1 275和1 656 bp。Western blotting检测到融合蛋白pcDNA3.1myc-HisA- Smad2/3/4的表达。结论:成功构建pcDNA3.1myc-HisA-Smad2/3/4真核表达质粒,同时鉴定其融合蛋白的表达。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

肺炎链球菌CbpA基因疫苗的构建及免疫学特性

目的：构建含有肺炎链球菌（SPN）毒力因子CbpA抗原编码基因的重组质粒pcDNA3.1/CbpA,测定其诱导特异性免疫应答的能力并评价其保护效果.方法：PCR扩增SPN CbpA编码基因,将该编码基因克隆到pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1/CbpA重组质粒,经测序鉴定后转染COS-7细胞,WesternBlot鉴定目的蛋白的表达,重组质粒免疫BALB/c小鼠,TIGR4型SPN攻击后,监测其生存时间.结果：CbpA能在COS-7细胞中表达;pcDNA3.1/CbpA重组质粒主动免疫BALB/C小鼠后,体内产生特异性IgG抗体,并诱导小鼠对SPN感染产生有效的保护.结论：成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1/CbpA,可为SPN基因疫苗的研制提供依据.     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.     

大鼠Smac基因的克隆及其在心肌细胞H9C2中的表达

目的：克隆大鼠促凋亡基因Smac,构建真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在心肌细胞中表达。方法：应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠肾组织中扩增到大鼠Smac基因的CDs片段,构建含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac并将此重组质粒、空载体pcDNA3.1⁺、pcDNA3.1⁺-EGFP通过脂质体介导转染大鼠心肌细胞H9C2,荧光显微镜、流式细胞术间接检测转染效率,RT-PCR法检测外源基因的表达。结果：经测序目的基因序列与GenBank（NM_001008292）公布的结果一致,所构建的重组质粒pcDNA3.1⁺-rSmac经PCR和酶切鉴定所释放的片段大小与预期结果相符。荧光显微镜和流式细胞术检测,细胞转染有效,转染效率达38.36%。转染重组载体pcDNA3.1⁺-rSmac 48 h后,H9C2细胞Smac的mRNA水平明显升高。其中,对照组Smac/β-actin为1.19,空载体组Smac/β-actin为1.31,二者之间差异无显著性（P>0.05）;转染pcDNA3.1⁺-rSmac组Smac/β-actin为1.67,与对照组比较差异具有显著性（P<0.01）。结论：克隆大鼠Smac基因成功,成功构建重组真核表达载体pcDNA3.1⁺-rSmac,并在转染后的心肌细胞中表达,为研究Smac基因在心肌细胞凋亡过程中的调控作用奠定基础。     

SOCS－3基因真核载体的构建及瞬时表达鉴定

目的构建含小鼠细胞因子信号抑制蛋白-3（SOCS-3）基因的重组pcDNA3.1质粒,同时瞬时转染后,鉴定其在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达。方法自小鼠肝脏标本中提取RNA进行RT—PCR,经克隆后获得pUC19-SOCS-3质粒,从中切出目的基因片段克隆至质粒pcDNA3．1中,以构建重组质粒pcDNA3.1-SOCS-3。后将构建完成的质粒瞬时转染COS-7细胞株,并随机分为未转染质粒组（对照组）、转染空质粒组和转染重组SOCS-3基因质粒组,同时采用免疫印迹法测定SOCS-3的表达。结果经测序鉴定证实,SOCS-3与美国国立生物技术信息中心核苷酸序列数据库提供的原始序列完全一致;同时经瞬时转染COS-7细胞后,转染重组质粒组的SOCS-3蛋白表达水平（光密度比值）显著高于对照组和转空质粒组（P〈0．01）。结论成功构建含小鼠SOCS-3基因的真核表达质粒,为进一步研究该基因在脂肪代谢中的抑制调节作用提供了技术平台。     

Construction and identification of eukaryotic eukaryotic expression plasmid pcdna3.1-bace and its transient expression in cells

Objective： To generate eukaryotic expression vector of pcDNA3.1-BACE and obtain its transient expression in COS-7 cells and high expression in the neuroblastoma SK-N-SH cells. Methods： A 1503 bp cDNA fragment was amplified from the total RNA of human neuroblastoma by RT-PCR method and cloned into plasmid pcDNA3.1. The vector was identified by digestion with restriction enzymes BamHI and XhoI and sequenced by Sanger-dideoxy：mediated chain termination. The expression of BACE gene was detected by immunocytochemistry method. Results： The results showed that the cDNA fragment included 1503 bp total coding region. The recombinant eukaryotic cell expression vector of pcDNA3.1-BACE was constructed successfully, and the sequence of insert was identical to the published sequence. The COS-7 cells and the neuroblastoma SK-N-SH cells transfected with the pcDNA3.1-BACE plasmid expressed high level of BACE protein in cytoplasm. Conclusion： The recombinant plasmid pcDNA3.1-BACE can provide very useful tool for researching the mason of Alzheimer＇s disease and lays the important foundation for preventing the AD laterly.     

人BPI活性片段基因真核表达载体的构建及其在COS-7 细胞中的表达

目的构建人杀菌/通透性增加蛋白(BPI)N端活性片段cDNA序列的真核表达载体并了解其在COS-7细胞中的表达. 方法提取人外周血多形核白细胞(PMN)总 RNA进行逆转录反应,经套式PCR扩增出BPI N端基因片段,将其克隆入pUC19载体中并进行酶切鉴定和序列测定,然后亚克隆入质粒pcDNA3构建真核表达载体pcDNA-BPI;重组载体通过脂质体转染 COS-7细胞,免疫荧光法鉴定BPI的表达. 结果酶切鉴定和序列分析证实重组质粒含有包括信号肽在内的BPI活性片段编码序列,转染实验表明重组质粒能在COS-7中表达出具有活性的 BPI片段. 结论 BPI活性片段真核表达载体构建及表达成功,为下一步BPI功能的研究奠定了基础.     

人pcDNA3.1-TPX2真核表达载体的构建与表达

目的:构建TPX2的真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并观察其在食管癌EC9706细胞中的表达。方法:在pQE-70-TPX2原核表达载体基础上,根据GenBank上提供的TPX2基因序列及测序结果,采用Primer Premier 5.0软件设计扩增TPX2基因编码区的引物序列,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切,与真核表达载体pcDNA3.1连接后转化感受态大肠杆菌JM109,并进行酶切分析和序列测定。将构建的质粒pcDNA3.1-TPX2体外转染EC9706细胞,进行稳定筛选。用Western blot鉴定基因的表达。结果:DNA测序和BLAST比对表明克隆的人TPX2基因序列正确,进一步酶切分析显示,成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-TPX2,并在EC9706细胞中获得稳定表达。结论:TPX2基因真核表达载体的成功构建为后续研究TPX2基因在肿瘤细胞中的功能奠定了基础。