阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因cap2037的克隆与表达

目的对阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因的克隆与原核表达。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TvV—T1序列设计一对引物，经RT—PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其克隆到pMD-18T载体后测序，并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析，再将其克隆至表达载体pET28a。并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果目的基因片段长度为2037bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的同源性最高为82．9％，构建原核表达载体pET—Cap2037；IPTG诱导后，SDS—PAGE显示表达产物的大小约75kDa。结论成功克隆出阴道毛滴虫病毒衣壳蛋白基因序列，与TVV—T1株序列有82．9％的同源性，经IPTG诱导，SDS-PAGE分析表明，75kDa蛋白基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达。     

阴道毛滴虫病毒RDRP基因的克隆与分析

目的对阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因的克隆,以便探讨其功能。方法提取阴道毛滴虫总核酸为模板,根据所克隆的阴道毛滴虫病毒部分序列和GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒TVV-T1序列设计一对引物,经RT-PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物,将其克隆到pMD-18T载体后测序,并与GenBank中核苷酸序列进行同源性搜索与分析。结果目的基因片段长度为2271bp,与阴道毛滴虫病毒T1株(U08999)的同源性最高为85.2%。结论国内首次成功克隆出阴道毛滴虫病毒RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)基因序列。     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的：探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1（CCNL1）基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法：构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K（含有KOZAK序列）的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果：在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论：在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

阴道毛滴虫dsRNA病毒部分基因的克隆与序列分析

提取阴道毛滴虫总核酸为模板，根据GenBank中发表的阴道毛滴虫病毒序列（U08999，NC003873，NC003824，NC003834）设计1对简并引物，经RT?鄄PCR得到与预计大小一致的PCR特异性产物，将其进行克隆、测序，得到目的基因片段长度为1 454 bp，与阴道毛滴虫病毒T1株（U08999）的序列同源性最高为82.9%。     

弓形虫GRA1基因的克隆与原核表达

目的:克隆并构建PET-28a-GRA1重组表达载体,转化人大肠杆菌E.coli BL21,诱导表达并鉴定,为进一步研究GRA1的生物学特性和免疫保护作用奠定实验基础.方法:根据GenBank中编码GRA1的已知基因序列设计并合成一对引物,应用PCR技术扩增GRA1基因,插入原核表达载体PET-28a中,构建重组表达质...     

KOZAK序列对乳腺癌MDA-MB-231细胞CCNL1基因表达的影响

目的:探讨KOZAK序列对细胞周期调节蛋白1(CCNL1)基因在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中表达的影响。方法:构建pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K(含有KOZAK序列)的真核重组表达质粒,采用Fugene HD转染试剂将重组表达质粒转染入MDA-MB-231细胞,并用荧光定量PCR和Western blot方法检测pcDNA3.1-CCNL1和pcDNA3.1-CCNL1-K重组质粒在MDA-MB-231细胞中表达的差异。结果:在MDA-MB-231细胞中质粒pcDNA3.1-CCNL1-K比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量要高;而质粒pcDNA3.1-CCNL1比空白对照细胞mRNA和蛋白质表达量也高。结论:在MDA-MB-231细胞中,质粒pcDNA3.1-CCNL1-K较pcDNA3.1-CCNL1的mRNA和蛋白表达水平均存在差异,KOZAK序列能够提高CCNL1基因在MDA-MB-231细胞中的表达。     

弓形虫亲环蛋白亚单位疫苗的免疫保护性研究

目的研究弓形虫亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)亚单位疫苗的免疫保护性。方法 30只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、佐剂组和PBS对照组,分别肌注pET-28a-TgCyP重组蛋白100μg/只、佐剂100 ul/只和PBS 100 ul/只,共免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠处死,取脾脏,检测CD4+、CD8+及细胞因子。同时,采用阿尔玛蓝细胞增殖与细胞毒性检测试剂测定小鼠脾淋巴细胞的增殖应答。其余小鼠腹腔攻击感染Rh株弓形虫速殖子500个,观察其存活情况。结果 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠的CD4+T细胞(62.59±4.17)%、CD8+T细胞(8.53±0.46)%与PBS及佐剂对照组比较显著增殖(P<0.01),其脾细胞培养液白细胞介素-2(IL-2)、γ干扰素(IFN-γ)显著升高,小鼠脾淋巴细胞增殖应答显著增强(P<0.01)。弓形虫攻击感染216 h后,实验组小鼠免疫保护率为33.3%,佐剂对照组及PBS对照组小鼠均全部死亡。结论 pET-28a-TgCyP重组蛋白亚单位疫苗具有较强的免疫原性,能...     

抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体的构建及其对虫体的杀灭作用

目的构建抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素原核表达载体并测定表达产物对隐孢子虫的杀灭作用。方法利用基因工程原理,以含抗隐孢子虫ScFv-PE重组毒素的菌株为模板,利用设计合成的一对引物扩增出ScFv-PE,利用pMAL-p2X载体构建重组毒素pMAL-ScFv-PE,并将其导入大肠杆菌中进行表达,产物进行SDS-PAGE和Western-blot,纯化后治疗感染隐孢子虫的小鼠。结果重组质粒经酶切鉴定正确,IPTG诱导后可看到明显的条带。凝胶薄层扫描分析目的蛋白表达量占菌体蛋白总量的21%。纯化后的表达产物治疗感染隐孢子虫的小鼠治疗组比对照组肠滞留物中卵囊计数（P〈0.05）与肠道平均累计感染积分明显减少（P〈0.01）。结论利用原核表达载体成功构建了可溶性形式表达的pMAL-ScFv-PE重组质粒,重组毒素对隐孢子虫具有明显的杀灭作用。     

十二指肠贾第虫Rab11互作蛋白的筛选

目的 Rab11属于Rab小分子GTP酶家族,主要参与贾第虫外泌体样囊泡的产生。研究贾第虫囊泡运输中的分子机制,探寻贾第虫Rab11蛋白的互作蛋白至关重要。方法 通过分子克隆技术构建含His标签的原核表达质粒pET-32a-Rab11,经诱导表达和纯化,获得Rab11融合蛋白(rGdRab11)。用该蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以此为抗体采用免疫荧光法观察Rab11蛋白的亚细胞定位。应用His-pull down联合质谱技术筛选贾第虫全虫蛋白中与Rab11蛋白互作的候选蛋白,并在GiardiaDB数据库和Revigo中对筛选的候选蛋白进行生物信息学分析。结果 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备鼠源抗Rab11多克隆抗体。免疫荧光法观察Rab11蛋白定位于贾第虫滋养体细胞膜区域和细胞质中。共筛选出528个与Rab11特异性结合的候选互作蛋白,其中蛋白质评分大于20分的候选互作蛋白有517个,包括124个未知蛋白,393个已知蛋白。GO分析上述蛋白涉及组蛋白修饰、组蛋白单泛素化、代谢过程、建立或维持细胞骨架极性以及内吞等多种生物进程。结论 成功表达和纯化出Rab11融合蛋白,并制备了...     

TIMP1基因对人结肠癌HCT-8细胞增殖影响的研究

目的采用体外试验探讨基质金属蛋白酶抑制剂1(TIMP1)基因对人结肠癌(HCT-8)细胞增殖的影响。方法构建TIMP1基因的真核表达载体和RNA干扰质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K、TIMP1 RNAi、pcDNA3.1和空白对照),将TIMP1基因真核表达质粒和RNA干扰质粒分别瞬时转染入HCT-8细胞48～72 h后,采用Real Time PCR方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中基因转录表达水平,并用Western blot方法检测TIMP1基因在HCT-8细胞中蛋白表达水平,采用MTT试验检测TIMP1基因过表达和干扰后对HCT-8细胞增殖的影响。结果成功构建了TIMP1真核表达质粒和RNA干扰质粒。与空白对照比较,质粒pcDNA3.1-TIMP1-K在HCT-8细胞中mRNA和蛋白的相对表达含量较高,质粒TIMP1 RNAi的mRNA和蛋白表达含量较低,差异均有统计学意义(P<0.05)。构建过表达质粒(pcDNA3.1-TIMP1-K)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞的活性无显著变化(P>0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够促进HCT-8细胞的增殖活性(P<0.05);构建干扰质粒(TIMP1 RNAi)转染HCT-8细胞后,与空白对照相比,第1～4天HCT-8细胞生长无显著变化(P>0.05),第5～7天TIMP1基因过表达能够抑制HCT-8细胞增殖(P<0.05)。结论 TIMP1基因过表达后能够促进人结肠癌细胞的增殖,在一定条件下还能够抑制人结肠癌细胞的增殖。