逆转录病毒上清液瘤内注射介导体内mdrl基因转移

目的 探讨逆转录病毒上清液瘤内及瘤周注射介导体内ｍｄｒｌ基因转移。方法 应用逆转录病毒上清液裸鼠皮下移植瘤内及瘤周注射法转移ｍｄｒｌ基因,腹腔注射化疗药物观察肿瘤模型的耐药性,免疫组化检测肿瘤细胞Ｐ－ＧＰ的表达,ＲＴ－ＰＣＲ检测肿瘤内ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ的表达量。结果 携带ｍｄｒｌ基因的逆转录病毒上清液注射后肿瘤模型表现出多药耐药性,高滴度病毒上清液可达到６０％细胞表达Ｐ－ＧＰ,是病毒原液基因转移率     

体内转导逆转录病毒HSVtk基因对鼠膀胱癌生长的影响

目的:观测瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体HSVtk基因对膀胱癌的作用.方法:用鼠膀胱癌细胞(T739)分别建立鼠背部和腹腔肿瘤模型.含HSVtk基因的病毒上清瘤体和腹腔内注射,联合丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)治疗观察肿瘤大小及动物存活时间.结果:接种后约1周所有动物长出肿瘤.HSVtk/GCV处理后,组织原位杂交显示瘤细胞内HSVtk基因mRNA表达.背部和腹腔肿瘤生长明显受到抑制,动物平均存活时间延长(P＜0.05)结论:瘤体和腹腔内注射逆转录病毒载体能将HSVtk基因导入膀胱癌细胞,联合GCV治疗显示出较强的抑瘤效应.     

乳腺癌mdrl基因表达调控的探讨

目的 探讨肿瘤多药抗性（mdrl）的基因调控及其特异的凋亡机制。方法在建立的mdrl肿瘤 裸鼠的瘤组织中，采用ＡＢＣ免疫组化法，检测Ｐ－１７０、c-myc、野生型p５３、p１６ 、Ｆas和Ｂcl－２等蛋白的表达。结果发现mdrl肿瘤细胞的c-mye不达增强；经抗mdrl-rebozyme部分逆转ＭＤＲ表型后，mdrl肿瘤细胞的p５３表达有所升高。结论c-myc、p５３可能参与了对mdrl基因表达的调控，其中c-myc可能起着激活mdrl基因转录的作用。实验还发现m     

肿瘤坏死因子α基因转染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞的实验研究

采用脂质体转染技术将能表达肿瘤坏死因子α（ＴＮＦ－α）基因的重组逆转录病毒质粒ｐＬ（ＴＮＦ－α）ＳＮ导入病毒包装细胞ＰＡ３１７，在细胞培养上清液中得到重组病毒，滴度为１．４×１０９ＣＦＵ／Ｌ。将此病毒上清液感染人脑胶质瘤浸润淋巴细胞（ＴＩＬ），用Ｇ４１８筛选出能表达标记基因ＮｅｏＲ的阳性克隆，ＥＬＩＳＡ法测得ＮｅｏＲ阳性ＴＩＬ培养上清液中存在ＴＮＦ－α，可达５３０ｎｇ／Ｌ，Ｌ９２９依赖细胞法并测出上清液中有ＴＮＦ－α生物学活性。结果表明，我们构建的重组逆转录病毒可介导ＴＮＦ－α基因在人脑胶质瘤ＴＩＬ中的表达     

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的 构建人骨形态发生蛋白（human bone morphogenetic protein7，hBMP－7）逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞（bone marrow-derived mesenchymal stem cell,MSCs)mRNA的表达。方法 构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞，采用原位杂交、RT－PCR检测hBMP－7mRNA在MSCs中的表达。结果 成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体，经hBMP－7基因转染的MSCs可表达外源性BMP－7mRNA。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将hBPM－7转染至MSCs中并表达外源性基因。     

逆转录病毒转染法建立耐药性大鼠CRBH-7919细胞系

目的:建立高效、稳定的大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系.方法:利用逆转录病毒转染法将带有mdr1 cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR转入到大鼠CRBH-7919细胞中,MTT法检测细胞系在不同化疗药物作用下的存活率;免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-GP)表达,RT-PCR检测细胞内mdr1 mRNA的表达量,PCR检测mdr1基因转移到细胞内的基因片段.结果:转基因的细胞系对阿霉素、丝裂霉素的耐药性分别提高 9和7.9倍,免疫组化见转基因细胞系P-GP表达增加,RT-PCR示细胞内mdr1 mRNA的表达量增加,PCR表明转基因细胞内扩增出mdr1片段.结论:利用逆转录病毒转染法成功建立了大鼠CRBH-7919多药耐药细胞系,该细胞系具有耐药强度高、耐药性稳定等特点.     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。     

逆转录病毒介导人重组骨形态发生蛋白基因转染骨骼肌卫星细胞mRNA的表达

目的：探讨逆转录病毒介导重组人骨形态发生蛋白7（recombinant human bone morphogenetic protein7,rhBMP7)基因转染骨骼肌卫星细胞的可行性及目的基因的表达情况。方法：体外获取和培养大鼠骨骼肌卫星细胞，构建rhBMP7逆转录病毒载体，利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67，经G418筛选后，制备含目的基因和重组逆转录病毒液，病毒液感染骨骼肌卫星细胞，使用RT－PCR方法检测rhBMP7 mRNA的表达情况。结果：成功地构建了逆转录病毒真核表达载体，逆转录病毒介导rhBM7基因转染的骨骼肌卫星细胞能有效地表达外源性rhBMP7的mRNA。结论：采用逆转录病毒介导的方法可将rhBMP7转染至骨骼肌卫星细胞中，目的基因可在mRNA水平有效表达。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

人γ-干扰素基因导入人大肠癌细胞中的方法及鉴定

目的：为将人γ-干扰素（huIFN-γ）huIFN-γ基因尽快用于临床基因治疗，寻求基因导入的有效方法。方法：利用导离子脂质体Lipofectamine将huIFN-γ基因导入人大肠癌细胞株，利用PCR、RT－PCR以该基因的整合和表达进行鉴定，并对细胞培养上清中γ-干扰素的活性进行了检测。结果：该基因已经有效地进入细胞内并实现了表达。结论：利用脂质体可以有效地将huIFN-γ基因导入肿瘤细胞内，基因表达的持续时间可以满足肿瘤基因治疗的需要，不同细胞株基上清中huIFN-γ的分泌量不同。     

逆转录病毒转染法建立兔VX-2多药耐药株

目的：建立VX-2多药耐药(MDR)细胞(VX-2mdrI)。方法：利用逆转录病毒转染法将带有mdrI cDNA全序列的逆转录病毒载体pHaMDR1转入到兔VX-2细胞中，MTT法检测细胞在不同化疗药物作用下的存活率；免疫组化检测细胞的P-糖蛋白(P-gp)表达，RT-PCR检测细胞内mdrI mRNA的表达量．结果：转基因的细胞对吡柔比星、秋水仙素的耐药性分别提高10和25倍，免疫组化见转基因细胞中P-gp表达增加，RT-PCR示细胞内mdrI mRNA的表达量增加。结论：利用逆转录病毒转染法构建了兔VX-2 MDR细胞。     

双功能逆转录病毒载体介导耐药基因转染人脐血CD34+细胞能增强联合化疗抗性

目的　为探讨转染醛脱氢酶基因 (ALDH1)和多药耐药基因 (MDR1)的人脐血CD34 细胞能否同吮增强对活性环磷酰胺 ( 4 HC)和P gp转运泵靶药的抗性。方法　构建了同时含ALDH1和MDR1双耐药基因的逆转录病毒表达质粒G1Na ALDH1 IRES MDR1,经LipofectAMINE介导转染GP E86和PA317包装细胞 ,采用含长春新碱 (VCR)和 4 HC的培养基克隆选择后 ,收集重组病毒上清于单向型与双嗜型包装细胞行乒乓交互感染 ,获得PA317重组病毒生产细胞 (最高滴度达 5 6× 10 5CFU ml) ,将含ALDH1和MDR1耐药基因重组病毒上清在细胞生长因子刺激下重复感染人脐血CD34 细胞。结果　经PCR ,RT PCR ,Southernblot,Northernblot,FACS和MTT方法检测显示外源ALDH1与MDR1基因已经整合入转染靶细胞中基因组并获得有效表达 ,同时传递不同的耐药表型。经耐药基因修饰的脐血CD34 细胞对 4 HC和P gp转运泵靶药同时产生抗性 ,其IC50值分别比未转染细胞高 4倍 ( 4 HC) ,5 5倍 (柔红霉素 DNR)和 7 2倍 (VCR)。结论　双功能逆转录病毒载体介导两种不同耐药基因转染人脐血CD34 细胞能增强联合化疗抗性 ,本基因转移系统的建立为开展肿瘤基因治疗的临床研究奠定了实验基础。     

急性髓系白血病H-ras、凋亡及多药耐药的研究

目的研究急性髓系白血病（ＡＭＬ）Ｈｒａｓ／Ｐ２１、抗凋亡基因（ｂｃｌ２）、细胞凋亡与多药耐药基因（ｍｄｒ１／Ｐｇｐ）对疗效的影响,并证实流式细胞术（ＦＣＭ）检测Ｐｇｐ和逆转录多聚酶链反应（ＲＴＰＣＲ）检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ间的相关。方法用ＦＣＭ检测８５例初治ＡＭＬ患者的Ｈｒａｓ／Ｐ２１、ｂｃｌ２、细胞凋亡和ｍｄｒ１产物Ｐｇｐ的表达;用ＲＴＰＣＲ检测其中４７例的ｍｄｒ１／ｍＲＮＡ。结果Ｐ２１＋／Ｐｇｐ＋者完全缓解（ＣＲ）率明显低于Ｐ２１－／Ｐｇｐ－者（分别为５８．１％和１００％,Ｐ＜０．０２５）,高ｂｃｌ２／Ｐｇｐ＋的ＣＲ率明显低于低ｂｃｌ２／Ｐｇｐ－者（分别为６０％和９６．３％,Ｐ＜０．００５）。Ｐｇｐ＋３１例中２９例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性,Ｐｇｐ－１６例中仅２例ｍｄｒ１ｍＲＮＡ阳性。结论Ｐｇｐ＋同时Ｐ２１＋、高ｂｃｌ２者ＣＲ低,ＦＣＭ检测Ｐｇｐ和ＲＴＰＣＲ检测ｍｄｒ１ｍＲＮＡ相关性良好     

Establishment of hepatocellular carcinoma multidrug resistant monoclone cell line HepG2/mdr1

Background  The multidrug resistance (MDR) associated with the expression of the mdr1 gene and its product P-glycoprotein is a major factor in the prognosis of hepatocellular carcinoma cell (HCC) patients treated with chemotherapy.  Our study was to establish a stable HCC MDR cell line where a de novo acquisition of multidrug resistance specifically related to overexpression of a transgenic mdr1.
Methods  The 4.5-kb mdr1 cDNA obtained from the plasmid pHaMDR1-1 was cloned into the PCI-neo mammalian expression vector, later was transferred by liposome to human hepatocarcinoma cell line HepG2. Then the transfected HepG2 cells resisting G418 were clustered and cultured and the specific fragment of mdr1 cDNA, mRNA and the P-glycoprotein (Pgp) in these HepG2 cells were detected by PCR, RT-PCR and flow cytometry, respectively.  The accumulation of the daunorubicin was determinated by flow cytometry simultaneously. The nude mice model of grafting tumour was established by injecting subcutaneously HepG2/mdr1 cells in the right axilla. When the tumour diameter reached 5 mm, adriamycin was injected into peritoneal cavity. The size and growth inhibition of tumour were evaluated.
Results  The mdr1 expression vector was constructed successfully and the MDR HCC line HepG2/mdr1 developed.  The PCR analysis showed that the specific fragment of mdr1 cDNA in HepG2/mdr1 cells, but not in the control group HepG2 cells. Furthermore, the content of the specific fragment of mdr1 mRNA and Pgp expression in HepG2/mdr1 cells were (59.7±7.9)% and (12.28±2.09)%, respectively, compared with (16.9±3.2)% and (3.07±1.06)% in HepG2 cells.  In the nude mice HCC model, the tumour genes of both groups were identified. After ADM therapy, the mean size of HepG2 cell tumours was significantly smaller than HepG2/mdr1 cell tumours.
Conclusion  The approach using the transfer of mdr1 cDNA may be applicable to the development of MDR hepatocarcinoma cell line, whose MDR mechanism is known. This would provide the experimental basis of MDR research.

     

胃、肠癌及癌旁组织MDR1基因表达的研究

目的：探讨胃、肠癌的原发耐药性及多药耐药基因（ｍ ｄｒ１）的肿瘤特异性。方法：以未接受肿瘤化疗的 ３１ 例胃癌和 ２４ 例结、直肠癌患者的癌及癌旁组织为研究对象,以逆转录 Ｐ Ｃ Ｒ 技术和 Ｄｏｔ ｂｌｏｔ 技术进行 ｍ ｄｒ１ 基因 ｍ Ｒ Ｎ Ａ 表达的研究。结果：①未接受化学治疗的胃癌患者的癌组织ｍ ｄｒ１ ｍ Ｒ Ｎ Ａ 呈阳性表达者占 ４８３９％ （１５／３１）,肠癌为 ５４１７％ （１３／２４）。②癌组织ｍ ｄｒｌ基因ｍ Ｒ Ｎ Ａ 高表达,癌旁组织的表达强度显著低于癌组织。结论：检测癌手术标本ｍ ｄｒ１ 基因可发现原发性耐药,对术后制定化疗方案有重要的参考价值。     

乳腺癌组织中多药抗药基因表达的临床意义

探讨多药抗药ｍｄｒ－１基因在乳腺癌化疗抗药中的作用和地位。方法采用逆转录－多聚酶链式反应技术，检测了８２例次乳癌组织的ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平。结果初治原发乳癌３５例，ｍｄｒ－１基因阳性表达３４．３％；复发转移乳癌４７例，ｍｄｒ－１基因阳性表达５９．６％。７例动态检测ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ水平的患者，化疗后表达水平均高于化疗前。化疗有效组１８例，ｍｄｒ－１基因阳性表达１６．７％，其中高度阳性表达５．６％；化疗无效组１４例，ｍｄｒ－１基因阳性表达７１．４％，其中高度阳性表达５０．０％。结论复治转移乳癌比初治原发癌具有更普遍的抗药性，且主要是获得性抗药；ｍｄｒ－１基因表达可以作为预测化疗效果的一个参考指标。     

复方浙贝颗粒联合阿霉素对K562／A02移植瘤mdr1基因表达的影响

目的：探讨复方浙贝颗粒联合阿霉素对K562／A02移植瘤多药耐药基因mdr1表达的影响。 方法：将人红白血病多药耐药细胞系K562／A02细胞接种于BALB／c—nu裸小鼠腋前皮下构建多药耐药移植瘤模型,给予不同剂量复方浙贝颗粒灌胃联合阿霉素腹腔注射治疗。治疗14d后处死小鼠,剥离肿瘤,检测各组移植瘤的瘤质量,计算抑瘤率;荧光定量聚合酶链式反应法检测各组移植瘤mdr1基因表达,2^-△△Ct法计算各组mdr1倍增变化率。 结果：各剂量复方浙贝颗粒联合阿霉素组的瘤质量明显低于模型组（P〈0．05）;高、中剂量复方浙贝颗粒联合阿霉素组的瘤质量明显低于阿霉素组（P〈0．05）;高、中剂量复方浙贝颗粒联合阿霉素组移植瘤mdr1基因表达较阿霉素组明显减少（P〈0．05）。 结论：复方浙贝颗粒（高、中剂量）联合阿霉素能够减少多药耐药移植瘤mdr1基因的表达。     

核酶对膀胱癌细胞系多药耐药性的逆转研究

目的：探讨核酶对膀胱癌多药耐生的逆转效应。方法：设计针对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ的“锤头状”（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅｌ,ＲＺ１）基因,定点克隆于逆转录病毒载体ｐＬＸＳＮ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点上,重组出带有核酶基因的逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１。应用脂质体ＤｏＴａｐ将ｐＬＸＳＮ－ＲＺ１导入到耐药的人膀胱癌细胞少。结论：本研究中设计的核酶能明显逆转膀胱癌细胞系多