新生大鼠肝干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养新生大鼠肝干细胞（HSCs）,并对其生物学特性进行鉴定。方法采用剪碎加酶消化法分离新生大鼠肝干细胞,用体积分数10%胎牛血清的H-DMEM培养液培养。以MTT法检测细胞的增殖情况,以RT-PCR检测肝干细胞特异性标记分子的表达。结果分离的新生大鼠肝干细胞体外培养24h已贴壁,3d左右可见克隆形成,呈铺路石样分布,光镜下细胞为方形或多角形,边缘清楚,细胞核及核仁明显,表达细胞角蛋白CK18、CK19、CK8、甲胎蛋白（AFP）等肝干细胞特异性标记分子,低度表达白蛋白。结论成功分离、鉴定出了新生大鼠肝干细胞,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

一种改进的大鼠胎肝干细胞分离纯化方法

目的 改进大鼠胎肝干细胞的分离纯化方法,提高肝脏干细胞分离的纯度和活力.方法 采用剪碎酶消化法分离大鼠胎肝干细胞,差速离心结合选择性消化法进行进一步纯化,含10％优等胎牛血清的DMEM/F12培养液培养.利用免疫细胞化学方法分别检测P1和P10代肝干细胞表面标志物.结果 分离的大鼠胎肝干细胞接种培养瓶24h后开始贴壁,5d后细胞体积增大,呈梭形或多边形.经1～2次差异性肖化传代后,细胞呈集落样生长,边缘清晰且折光率强.免疫细胞化学检测示:P1代大鼠胎肝干细胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、细胞角蛋白(CK) 19呈阳性表达,不表达Alb.P10代肝干细胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈阳性表达.结论 大鼠胎肝干细胞分离纯化、培养扩增及鉴定方法简单易行.     

干细胞样肝原始细胞的体外分化

目的：探讨干细胞样肝原始细胞集落体外分化的潜能。方法：分离孕13.5d的C57BL／6小鼠胎肝组织细胞并培养，第2天出现圆形成椭圆形干细胞肝原始细胞集落，随机挑取边界清楚的细胞集落分别培养，利用倒置相差显镜连续观察细胞生长过程中的形态学变化并用显微摄影记录结果，最后利用免疫细胞化学分析鉴定分化后细胞的性质。结果：干细胞样肝原始细胞集落在体外培养时可形成类似肝小叶的形状，集落中央大部分细胞分化成双核细胞，集落周边细胞仍为单核细胞，但体积明显增大，整个集中的细胞呈放射状排布。分化后，细胞群中的部分细胞表达成熟肝细胞标志白蛋白（albumin)，少部分细胞表达胆管上皮细胞标志细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19)，但所有细胞均不表达低分化肝细胞标志α－甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP)。结论：干细胞样肝原始细胞在体外具有我向分化能力，可分化为表达成熟肝细胞的胆管上皮细胞标志的细胞。     

胎肝滤液诱导大鼠胎盘间充质干细胞向肝细胞的分化

目的 探讨PDMSCs向肝细胞增殖和分化的体外培养条件及方法.方法 孕20 d的大鼠无菌条件下取胎盘,经胶原酶消化、密度离心、贴壁筛选法分离培养胎盘源间充质干细胞,并对其表面抗原进行鉴定.在体外培养体系中加入胎肝滤液,模拟体内肝脏微环境,诱导PDMSCs向肝细胞定向分化,以免疫细胞化学检测干细胞标志物；PAS检测糖原表达.结果 在体外培养条件下,PDMSCs贴壁生长为成纤维样细胞,CD44表面标志物检测阳性；PDMSCs经胎肝滤液诱导14d时细胞呈现圆形、卵圆形的特征性改变,AFP、CK19表达阳性.结论 胎肝滤液能够诱导PDMSCs定向分化为肝细胞样细胞.     

人胎肝干细胞的体外诱导分化

目的 :体外分离和诱导分化人胎肝干细胞。方法 :原代分离培养人胎肝干细胞集落 ,免疫细胞化学鉴定细胞集落分子标志物的表达 ;在体外因子作用下诱导干细胞定向分化为成熟肝脏细胞 ,对其生物学特性进行初步鉴定。结果 :从人胎肝组织中成功分离表达AFP、Albumin、Cytokeratin等标志物的胎肝干细胞集落 ;在体外因子作用下肝干细胞定向分化为成熟肝脏细胞。结论 :人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞 ,体外可定向分化为成熟肝细胞。人肝干细胞的分离培养对于肝脏发育及其病理学的深入研究奠定了良好的基础。     

胎儿肝干细胞的分离、鉴定及培养

目的：分离、鉴定人胎肝中肝干细胞并短期培养,为体外扩增及诱导分化实验提供细胞来源。方法：采用原位两步胶原酶灌注结合Percoll液密度梯度离心的方法分离、纯化胎肝中肝干细胞,用光镜、电镜观察所得细胞形态,通过免疫细胞化学染色检测细胞AFP、CK19、CD34。测量肝脏重量及获得的肝干细胞数量,计算肝干细胞产量,对肝干细胞进行短期培养。结果：两步胶原酶灌注可有效消化胎儿肝脏结缔组织,分离的肝脏细胞经不连续Percofl密度梯度离心,可得到肝干细胞,细胞活性率为（88．35±2．45）％（n=30）。光镜下肝干细胞呈卵圆形,直径约为成熟肝细胞的1／3,电镜下肝干细胞直径约10um,细胞大部分被卵圆形细胞核所占据,细胞质少,核浆比例大,内质网、线粒体、高尔基体等细胞器不发达。ABC法免疫细胞化学染色显示：胎儿肝干细胞CK19、CD34及AFP呈阳性信号。对肝干细胞进行培养,12h后肝干细胞逐渐粘附、贴壁、铺展,呈现为圆形、椭圆形,呈上皮细胞样平铺生长。肝干细胞产量为（8．76±0．46）×10^6个／g（n=15）。结论：两步胶原酶灌注结合不连续Percoll液密度梯度离心法可较好地分离纯化胎儿肝干细胞,所得细胞可体外培养,可做为进一步实验的材料。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离培养及鉴定。方法：应用贴壁筛选法分离培养Wistar大鼠髓间充质干细胞,用直接荧光抗体染色法对培养的细胞进行鉴定。结果：体外培养的原代MSC 9d融合,荧光抗体染色CD44、CD105表达阳性,CD14、CD34表达阴性。结论：贴壁筛选法在体外很容易分离培养和扩增MSC,可作为获得MSC的一种有效手段。     

具有双向分化潜能的鼠胎肝干细胞的分离、培养及鉴定

目的：优化体外分离、培养和筛选胎鼠肝脏干细胞（LSC）的方法,并鉴定其双向分化的潜能。方法通过密度梯度离心和细胞差异性贴壁法分离小鼠胎肝干细胞（FLSC）,以细胞平板克隆技术和四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定FLSC的增殖,通过添加二甲基亚砜（DMSO）和 HGF等诱导干细胞分化。结果分离后的FLSC 24 h内贴壁,卵圆形,排列紧密,1～2周内活化, CD133、CD49f、EPCAM的阳性率分别为（97．95±1．21）％、（92．71±3．49）％、和（50．73±3．45）％,表达甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白19（CK19）;诱导分化后糖原染色（PAS）法染色可见红色糖原颗粒,表达清蛋白（ALB）、肝细胞核因子4α（HNF‐4α）。结论联合密度梯度离心和差异性贴壁法成功分离FLSC ,分离后的FLSC干性强,增殖能力强,具有向肝细胞和胆管上皮细胞双向分化的能力。     

C57胚胎小鼠神经干细胞的分离、培养与鉴定

目的体外分离、培养神经干细胞（NSCs）,并对其进行鉴定。方法采用手动法及胰蛋白酶消化法分离胎鼠脑细胞,用优化的无血清NSCs培养基进行培养。细胞免疫荧光法检测NSCs特异性标记分子的表达。结果分离的脑细胞体外培养48 h已大部分贴壁,3 d左右获得大量未分化呈巢状悬浮生长的神经干细胞团。第3代时,很少见到贴壁细胞,几乎全是神经球,神经球周围存在较多微刺。细胞表达一种中间丝蛋白,即巢蛋白（nestin）。结论成功分离、鉴定出C57小鼠NSCs,并可在体外条件下进行传代扩增培养。     

胚胎大鼠神经干细胞的培养及鉴定

目的：探讨胚胎大鼠神经干细胞培养，传及鉴定方法。方法：从胚胎大鼠脑室下区（SVZ）组织分离得到神经干细胞，采用无血清培养技术进行培养，并诱导分化，采用SABC法对分化后后的细胞进行神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸蛋白（GFAP）检测及姬姆萨染色进行细胞鉴定。结果：成功培养出了胚胎大鼠神经干细胞，培养出的细胞具有自我更新能力的增殖能力，可分化为神经元，神经胶质细胞及少突胶质细胞，结论：胚胎大鼠神经干细胞在体外适宜的培养条件下具有自我更新，增殖和多向分化潜能。     

人胎肝干细胞体外分离培养及脾内移植的初步研究

目的 将人胎肝于细胞脾内移植2/3肝切除的严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠,观察其在受体小鼠内定植、迁移及分化的可行性.方法 ①以临床上自然流产废弃的孕期16～24周健康胎肝为供体,分离纯化胎肝干细胞,并行光镜、电镜观察及免疫细胞化学和流式细胞检测鉴定.②人胎肝干细胞经脾内移植到2/3肝切除的SCID小鼠.③免疫组化检测15、30、60、90 d受体小鼠脾脏和肝脏的人Hepatocyte、α1-AT、AFP的定位和表达.PAS染色检测受体小鼠各时间点脾脏组织糖原表达.④RT-PCR检测30、60、90 d受体小鼠脾脏组织AFP和白蛋白(Alb)基因的表达.结果 ①镜下观察分离细胞体积较小、约为肝细胞的1/6～1/3,核与浆比例大,内质网、线粒体和核糖体不发达.免疫细胞化学和流式细胞检测分别显示分离的人胎肝干细胞表达AFP、Thy-1、C-kit和CD34、CK19.②各时间点免疫组化均可检测到肝干细胞移植小鼠的肝脏和脾脏组织人Hepatocyte、α1-AT和AFP阳性表达.PAS染色显示各时间点受体小鼠脾脏组织不同程度的糖原表达.③人胎肝干细胞移植后30、60、90 d受体小鼠脾脏组织表达人AFP和Alb基因.结论 人胎肝干细胞经脾内移植可在异体内存活、定植并向受体受损肝脏迁移,在受体内增殖和定向分化为肝细胞.     

人胚胎肾间质成纤维细胞培养及其鉴定

目的：探讨人胚胎肾脏成纤维细胞培养方法。方法：利用人胚胎肾脏肾髓质进行培养，然后通过细胞形态学，超微结构，免疫细胞化学等方法进行分析鉴定。结果：培养的细胞为长梭形，单核，超微结构为典型的成纤维细胞，并表达成纤维细胞表面抗原，波形蛋白，结蛋白，不表达角蛋白。结论：成功地培养出人胚胎肾间质成纤维细胞。     

人胎肝干细胞的分离、培养和鉴定

为探讨人胎肝中干细胞的存在并对其生物学特性进行鉴定 ,采用原代分离法培养人胎肝细胞集落 ,免疫组化鉴定细胞集落分子标志物的表达。结果 :从人胎肝组织中成功分离表达甲胎蛋白 (AFP)、白蛋白、波形蛋白等标志物的胎肝干细胞集落。证实人胎肝中同样存在具有干细胞特性的原始细胞。这一发现为肝干细胞的生物学特性的深入研究奠定了良好的基础     

骨组织工程支架体外血管化初步研究

目的 观察兔骨髓诱导的内皮细胞用纤维蛋白胶接种到骨组织工程支架上,在体外人工骨血管化效果.方法 梯度离心分离兔单个核细胞,直接向内皮细胞方向诱导培养,传代培养至第3代细胞,倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,第2代细胞作免疫组化鉴定和内皮细胞功能实验;以107/ml密度稀释于纤维蛋白凝胶中并接种到脱钙骨基质支架上,培养并定期观察细胞在支架上的生长情况,细胞支架复合物切片并作HE染色和电镜观察细胞在支架内的生长.结果 诱导的内皮细胞为铺路石样,第2代细胞八因子相关抗原免疫组化为阳性,摄取低密度脂蛋白和结合凝集素实验均阳性;细胞在支架内呈立体生长,细胞在支架内3d后成梭形铺开,6d后自发形成管腔样结构并在支架表面形成内皮样结构.结论 骨髓诱导的内皮细胞在脱钙骨支架内可以在体外培养成管腔样内皮样结构.     

随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞及其鉴定

目的 寻找一种培养及鉴定大鼠主动脉内皮细胞的简便方法.方法 采用随机贴块法培养大鼠主动脉内皮细胞并用差速消化法加以纯化,观察细胞形态学特性,用抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验鉴定.结果 培养3d即有细胞生长,1周可融合成层.抗vwF抗体免疫荧光染色及内皮细胞体外成管试验阳性.结论 本方法简便易行,适于推广应用.     

胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞的分离鉴定

目的：建立胎儿肝脏与骨髓间充质干细胞(MSCs) 的分离培养方法,并对两种来源细胞的生物学特性加以鉴定。方法：取胎龄4或5月水囊引产胎儿肝脏和骨髓,用1.073 g·mL^-1的percoll密度梯度离心分离低密度细胞,MSCs培养基纯化贴壁细胞,用流式细胞术检测其表面标志,成脂肪及成骨诱导鉴定多向分化潜能,对比两种来源的MSCs增殖及生长特征。 结果：胎儿肝脏及胎儿骨髓MSCs CD29、CD44、CD73（SH-3,4）、CD105（SH-2）、CD166、HLA-ABC阳性,CD35、CD45、HLA-DR阴性,均能成脂肪及成骨诱导分化,随MSCs 数量增加,其对外周血T 淋巴细胞转化的抑制作用增强。结论：胎儿肝脏和骨髓中可成功分离MSCs。     

大鼠胎肝前体细胞的分离培养

目的：探索胚龄(ED)13．5d大鼠胚胎肝脏中肝前体细胞的生物学特性，为细胞移植及基因导向治疗奠定基础。方法：酶消化法分离肝前体细胞，观察不同体外培养对肝前体细胞生物学功能的影响，并用免疫组化方法鉴定分离培养细胞的分化标志。结果：肝前体细胞在原代胚胎成纤维细胞饲养层(PREF)培养，其增殖能力较无饲养层培养强，原代培养可保持未分化状态。细胞分化标志鉴定提示EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞中存在双分化能力的细胞。结论：EDl3．5d大鼠胚肝前体细胞存在双分化能力的原始肝细胞，肝前体细胞可在PREF进行体外扩增。     

新生大鼠视网膜神经元的原代培养与观察

目的：建立新生大鼠视网膜神经元体外培养的有效方法。方法：取出生后1～3?d的Wistar大鼠视网膜,胰蛋白酶+依地(EDTA)消化制成单细胞悬液,接种于置有包被多聚赖氨酸(poly L lysine)玻片的24孔培养板中培养,利用相差显微镜对培养的细胞进行动态观察;并以免疫细胞化学技术对视网膜神经元进行染色。结果：在多聚赖氨酸上培养的视网膜神经元生长良好,部分细胞伸出突起,且有些突起相互连接。免疫细胞化学染色显示,培养的细胞大多数抗神经丝蛋白（NF）抗体反应阳性。胰蛋白酶+EDTA联合消化能使视网膜细胞很好得分离,获得视网膜单细胞悬液。结论：酶消化法原代培养视网膜神经元有较好的视网膜神经元生长率;胰蛋白酶+EDTA联合消化较单独用胰蛋白酶消化效果好。     

以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜的构建及移植

目的进行体外分离和培养兔角膜缘干细胞,使之成为一种上皮组织,以便进行角膜移植。方法组织块法体外培养兔角膜缘干细胞：角膜缘组织块作为外植体,在脱细胞猪角膜基质上培养;获得的复合角膜上皮组织移植于兔眼,观察并记录兔角膜组织生长情况,待角膜组织生长良好后做免疫组织化学鉴定。结果兔角膜缘组织应用组织块法在脱细胞角膜基质上生长9~10 d后达到80%汇合状态,显微镜下动态观察细胞生长良好,增殖能力较高,将组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植于兔眼后,4~5 d角膜上皮光滑,20~21 d角膜变为透明,荧光素染色只见缝线处少许着色,期间未见角膜移植排斥反应。术后30 d HE染色显示角膜组织与宿主角膜组织结合良好,上皮细胞可见4~5层结构,可见角膜缘干细胞多呈卵圆形;免疫荧光染色可见培养的细胞P63、CK3单克隆抗体呈阳性表达。结论以组织块法生长的以脱细胞角膜基质为载体的组织工程化兔角膜可在角膜缘干细胞缺乏的兔眼上生长良好。