凝血栓蛋白-1I型重复序列真核表达载体的构建

目的构建凝血栓蛋白-1I重复序列真核表达载体.方法采用RT-PCR技术,从人胎儿肺组织中扩增凝血栓蛋白-1 I型重复序列基因,通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定及测序.结果获得了预期的扩增产物——凝血栓蛋白-1 I型重复序列基因,测序结果经GenBank分析,一致性为99%.结论成功构建了PcDNA3.1+/TSP-1 I型重复序列真核表达载体.     

凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列真核表达载体的构建

目的构建凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列真核表达载体。方法采用RT-PCR技术,从人胎儿肺组织中扩增凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列基因,通过连接反应构建重组克隆载体和重组表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,双酶切鉴定及测序。结果获得了预期的扩增产物———凝血栓蛋白-1Ⅰ型重复序列基因,测序结果经GenBank分析,一致性为99%。结论成功构建了PcDNA3.1+/TSP-1Ⅰ型重复序列真核表达载体。     

人核糖体蛋白L6编码基因的克隆及正反义真核表达载体的构建

目的：通过克隆人核糖体蛋白L6（RPL6） cDNA序列，构建其正反义真核表达载体，以探讨RPL6与白血病多药耐药的关系。方法：用RT—PCR技术扩增RPL6 cDNA序列，DNA重组技术构建其正反义真核表达载体。结果：成功扩增RPL6 cDNA序列，经DNA测序，证实与GenBank中的人RPL6编码区序列一致，酶切证实目的基因分别按正反两个方向亚克隆至真核表达载体。结论：成功克隆人RPL6 cDNA序列，并构建了正反义真核表达载体。     

胰高糖素样肽-1基因荧光真核表达载体的构建及鉴定

目的：克隆大鼠胰高糖素样肽-1（GLP-1）的编码基因，构建荧光真核表达载体，为研究GLP-1与糖尿病的相关性奠定实验基础。方法：用RT-PCR方法从大鼠胰腺组织中扩增GLP-1的编码基因，克隆至PMD18-T载体并测序，结果正确后亚克隆至荧光真核表达载体pEYFP-N1中。结果：测序证实从胰腺中扩增出的GLP-1编码基因的序列及读框全部正确，重组质粒pEYFP-GLP-1经酶切后产生与理论预期长度相符的片段。结论：克隆了大鼠GLP-1的编码基因，成功构建了荧光真核表达载体pEYFP-GLP-1。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因真核表达载体的构建

目的：构建编码弓形虫RH株三磷酸核苷水解酶（NTPase-Ⅱ）重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ。方法：采用PCR从弓形虫基因组DNA中扩增NTPase-Ⅱ基因,克隆入pGEM-T Easy载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR、酶切和测序鉴定;采用亚克隆将NTPase-Ⅱ基因克隆至真核表达载体PVAX1,筛选阳性重组质粒PVAX1-NTPase-Ⅱ,进行PCR、酶切和测序鉴定。结果：NTPase-Ⅱ的重组真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,大小为1 887 bp,与预期大小一致;重组真核表达载体的核苷酸序列,与GenBank中的相应序列100%同源。结论：成功构建重组真核表达载体PVAX1-NTPase-Ⅱ,为弓形虫核酸疫苗的研制奠定了基础。     

mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的：构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的反义RNA真核表达载体，观察其对血管平滑肌细胞（VSNC）功能的影响。方法：提取人VSMC总RNA，反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增mTOR基因cDNA序列，经pGEM-T载体克隆后双酶切，将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1，构建mTOR基因反义RNA真核表达载体。转染VSMC，采用Western blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响，流式细胞仪检测细胞周期的变化。结果：经RT-PCR获得664bp产物，T载体克隆后，经DNA测序，确定该片段为mTOR基因cDNA，进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR，测序证明序列正确后转染VSMC，证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达，VSMC的分裂、增殖过程受阻。结论：已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体。     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的：构建E型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法：根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAⅡ载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Western blotting方法鉴定表达产物。结果：从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论：成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

人CMV/ARL-1真核表达载体的构建

目的构建人GMV/ARL-1真核表达载体,为进一步建立转ARL-1基因Hep-G2单克隆细胞系奠定基础.方法采用限制性内切酶技术,酶切真核骨架质粒pBK/CMV及另一质粒pBK/ARL-1(内含ARL-lcDNA全长),用TONA连结酶将目的基因连至骨架质粒上,酶切及序列分析的方法鉴定重组质粒.结果经Eco R I、Nco I、Uind Ⅲ酶切鉴定和序列分析,证明ARL-1基因已插入到pBK/CMV真核表达载体上.结论成功地构建了CHV/ARL-1真核表达载体.     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

人DNA修复基因HOGG1真核表达载体的构建及序列测定

目的: 克隆人HOGG1基因并构建其真核表达载体,进行序列测定. 方法: 提取人胎肝总RNA,设计HOGG1特异性引物,通过RT-PCR扩增,将HOGG1基因克隆到pCMV-Myc载体,菌落PCR鉴定阳性克隆并测序验证. 结果: 获得人HOGG1基因全长,并成功构建pCMV-Myc/HOGG1真核表达载体. 结论: HOGG1真核表达载体的构建为HOGG1基因生物靶向治疗药物的开发提供一种新的手段.     

小鼠共刺激分子B7-1的分子克隆、测序与真核表达载体的构建

目的：克隆小鼠共刺激分子B7－1基因，测序并构建其真核表达载体。方法：从小鼠脾组织中提取总RNA，用RT－PCR方法将B7－1的DNA扩增出，克隆到真核表达载体pcDNA3中，测定其cDNA序列。结果：测序结果表明我们克隆的B7－1基因序列与GenBank中序列有1个碱基不同，所编码的氨基酸发生突变。结论：已成功构建小鼠B7－1的真核表达载体，为进一步应用B7－1进行肿瘤基因治疗打下基础。     

大鼠Atoh1基因真核表达载体的构建及转染293T细胞的实验研究

摘要：目的利用基因工程方法克隆SD大鼠Atoh1基因CDS,构建大鼠核转录因子Atoh1的真核表达载体并在真核细胞
中表达。方法从SD大鼠结肠粘膜提取总RNA,采用逆转录PCR法扩增Atoh1基因CDS区序列并TA克隆至PMD-19T
载体中。测序鉴定后将Atoh1基因连接于含有EGFP和内部核糖体转入位点（internal ribosome entrysite, IRES）的真核细
胞表达载体pIRES2-EGFP中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至293T细胞,荧光显微镜、
PT-PCR和Western blot检测其在293T细胞中的表达。结果扩增得到大鼠Atoh1 CDS区长1056 bp,编码351个氨基酸,
与GeneBank公布的参考序列对比,有两处碱基发生突变,但克隆序列编码的氨基酸序列与参考序列完全一致,两处碱基
应为单核苷酸多态性（SNP）,突变为无义突变,不影响蛋白表达。双酶切和测序结果证明Atoh1已正确地克隆到真核表达
载体pIRES2-EGFP中,转染293T细胞48 h后,荧光显微镜下观察到荧光蛋白的表达,PT-PCR和Western blot证实Atoh1
的mRNA和蛋白能在293T细胞中正确表达。结论成功构建了真核表达载体pAtoh1 -IRES2-EGFP,并在293T细胞中成
功表达,为进一步研究Atoh1的功能、作用机制及感音神经性耳聋的基因治疗奠定了基础。     

重组人白介素27真核表达载体的构建

目的克隆人IL-27基因,构建其真核表达载体。方法从人外周血单核细胞诱导而成的树突状细胞中提取总RNA,采用RT-PCR克隆人IL-27亚基EBI3和p28基因,Xho I和EcoR I双酶切后插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建人IL-27真核表达载体pcDNA3.1-EBI3和pcDNA3.1-p28。结果双酶切及测序结果表明构建载体中的EBI3与p28序列与文献报道一致。结论重组人IL-27真核表达载体的构建成功,为表达出有活性的重组人IL-27奠定了基础。     

用于双分子荧光互补技术的Olig1/Id2基因真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒,并进行鉴定。方法:以pEGFP-N3-Olig1真核表达质粒为模板扩增出Olig1基因,与pBiFC-VN173载体连接,构建pBiFC-VN173-Olig1真核表达质粒;利用RT-PCR方法从新生大鼠脊髓中提取Id2基因片段,与pBiFC-VC155载体连接,构建pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒。对此2种质粒进行酶切鉴定、测序。结果:通过酶切鉴定、测序,证明pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2重组质粒序列和编码框均正确构建成功。结论:成功构建了pBiFC-VN173-Olig1和pBiFC-VC155-Id2真核表达质粒,为进一步在活细胞内研究Olig1和Id2的相互作用提供了实验基础。     

大鼠β神经生长因子前体基因的克隆及其真核表达载体pEGFP-NGF的构建

目的克隆大鼠脑组织中神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,构建其真核表达载体pEGFP-NGF。方法采用RT-PCR方法扩增NGFβ亚基前体的全长序列,克隆入载体pMD18-T,转化大肠杆菌JM109,挑选白色菌落行酶切鉴定、PCR鉴定及序列分析;利用高保真Taq酶自重组质粒pMD 18-T／NGF中扩增目的基因NGF,将目的基因与真核表达载体pEGFP-N1行双酶切,T4连接酶连接,转化大肠杆菌DH-5α,挑选白色菌落行酶切鉴定。结果pMD 18-T／NGF测序结果与GenBank的序列完全一致,pEGFP-NGF、行限制性内切酶HindⅢ、BamHⅠ酶切,可见酶切片断与插入基因长度相符。结论成功从大鼠脑组织中克隆神经生长因子(NGF)β亚基前体的全长序列,并构建其真核表达载体pEGFP-NGF,为从分子水平开展NGF转基因相关研究奠定了基础。     

人源性肝细胞生长因子高效真核表达载体的构建

目的：通过基因克隆构建人源性肝细胞生长因子(hHDSSF)真核高效表达重组体。方法：通过T-A克隆构建hHDSSF中间重组体pGEM-hHDSSF；酶切鉴定后构建真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF；末端终止法测定插入片断基因序列。结果：酶切证实hHDSSF完整插入pGEM中；酶切筛选得到正向插入的真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF，并经序列分析证明。结论：成功构建了真核表达重组体pcDNA3．1hisB-hHDSSF，为进一步转染真核细胞建立稳定的转染表达细胞株和高效表达hHDSSF奠定了坚实的基础。