聚焦层析法分离人血清载脂蛋白CⅢ亚型

用密度梯度超速离心法,从混合人血清中分离极低密度脂蛋白,经脱脂后再进行聚焦层析分离其中的载脂蛋白。获得的纯品载脂蛋白ＣⅢ１和ＣⅢ２经等电聚焦电泳均呈现一条带。生物活性的细胞学实验鉴定发现,纯化载脂蛋白ＣⅢ能抑制培养ＨｅｐＧ２细胞对标记极低密度脂蛋白的提取。聚焦层析方法简便,一次上样量大,速度快,分离效果好,还可同时获得载脂蛋白ＣⅠ,ＣⅡ和Ｅ,是分离纯化脱脂极低密度脂蛋白中载脂蛋白的较好方法     

结核分枝杆菌furB基因的克隆、表达和纯化

目的: 从H37Rv基因组中扩增furB并高效表达和纯化. 方法: 用PCR技术从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增furB序列,将其与pGEM-T-Easy载体连接转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/furB,测序正确后将目的基因片断克隆入pQE-80L原核表达载体并转化E.coli DH5α,IPTG诱导目的蛋白表达. 经Western blot鉴定目的基因与(His)6融合表达,将已表达的蛋白质通过Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化. 结果: PCR得到结核分枝杆菌furB,测序结果与Genbank中报道的完全一致. SDS-PAGE显示,在Mr为15.0×103处有相应的蛋白质表达条带,Western blot鉴定为(His)6融合表达蛋白. 经Ni2 -NTA亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白. 结论: 成功克隆了铁调节蛋白基因furB序列,并在E.coli DH5α高效表达,亲和层析后获得了纯化目的蛋白.     

仓鼠经口给予亚砷酸盐后血浆中砷结合蛋白的纯化

目的：探索用凝胶过滤柱和阴离子交换柱,结合电感耦合等离子质谱仪分离纯化砷结合蛋白,为阐明砷的毒理机制提供技术支持。
方法：通过HPLC-ICP-MS技术,采用KW-803色谱柱、凝胶过滤柱和离子交换柱分离纯化仓鼠血浆中的砷结合蛋白;SDS-PAGE凝胶电泳分析由HPLC-ICP-MS系统凝胶过滤柱和离子交换柱获得的每个蛋白样本。
结果：①仓鼠单次经口给予三价亚砷酸（iAsⅢ）后,运用三步法即利用凝胶过滤、KW-803色谱柱和阴离子交换等色谱柱联用HPLC-ICP-MS,最后纯化得到了仓鼠血浆中砷结合蛋白;②SDS-PAGE凝胶电泳分析由HPLC-ICP-MS系统联用不同凝胶过滤柱和离子交换柱获得的每个蛋白样本,检测到砷结合蛋白分子量大约40~50 kD。
结论：凝胶过滤柱和阴离子交换柱,结合电感耦合等离子质谱仪是分离纯化动物血浆或组织上清砷结合蛋白简便快速的方法。     

苦瓜子蛋白分离纯化及其理化性质鉴定

目的建立苦瓜子蛋白分离纯化的方法。方法应用阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱Hiprep16/10SOURCE30S和HiLoad26/60Superdex75预装柱从苦瓜种仁中分离纯化苦瓜子蛋白。结果分离纯化出14个组分的苦瓜子蛋白,它们均为碱性蛋白质,相对分子质量在(1.3~2.9)×104,等电点在9.3~9.6。结论应用本法能获得供生物活性研究用苦瓜子蛋白组分。     

细胞实验检测蓖麻蚕蛹生物反应器表达的重组人表皮生长因子的生物学活性

目的探讨蓖麻蚕蛹生物反应器中分离纯化获得的重组人表皮生长因子(rhEGF)蛋白质的生物学活性。方法采用Tricine-SDS-PAGE和免疫印迹法(Western blot)鉴定rhEGF,通过MTT和台盼蓝法检测rhEGF的细胞活性。结果 Tricine-SDS-PAGE、Western blot结果显示,蓖麻蚕蛹中分离纯化获得的rhEGF具有正确的分子量和免疫原性;MTT法显示,纯化的rhEGF具有酶促活性,且酶促活性优于rhEGF标准蛋白(P<0.05),其最高活性浓度为1.0μg/L,在0.0625～1.0μg/L浓度范围内具有剂量依赖性;rhEGF能够促进Balb/c3T3细胞的分裂增殖,效果优于rhEGF标准蛋白(P<0.05)。结论 AnpehEGF感染的蓖麻蚕蛹中分离纯化获得的rhEGF,具有类似天然hEGF的生物学活性,且效果优于rhEGF标准蛋白;rhEGF的细胞实验为进一步的动物实验提供了基础。     

Expression of Recombinant Human Epidermal Growth Factor in Samia Cynthia Ricini Pupae Bioreactor and Its Biological Activity

目的 探讨蓖麻蚕蛹生物反应器中分离纯化获得的重组人表皮生长因子(rhEGF)蛋白质的生物学活性.方法 采用Tricine-SDS-PAGE和免疫印迹法(Western blot)鉴定rhEGF,通过MTT和台盼蓝法检测rhEGF的细胞活性.结果 Tricine-SDS-PAGE、Western blot结果显示,蓖麻蚕蛹中分离纯化获得的rhEGF具有正确的分子量和免疫原性;MTT法显示,纯化的rhEGF具有酶促活性,且酶促活性优于rhEGF标准蛋白(P＜0.05),其最高活性浓度为1.0 μg/L,在0.0625～1.0 μg/L浓度范围内具有剂量依赖性;rhEGF能够促进Balb/c3T3细胞的分裂增殖,效果优于rhEGF标准蛋白(P＜0.05).结论 AnpehEGF感染的蓖麻蚕蛹中分离纯化获得的rhEGF,具有类似天然hEGF的生物学活性,且效果优于rhEGF标准蛋白;rhEGF的细胞实验为进一步的动物实验提供了基础.     

人血小板膜糖蛋白GPIbα（H1-V289）的原核表达及其生物活性研究

目的获得重组的血小板膜糖蛋白GPIbα的N端片段（1-289氨基酸）,进一步研究其在血栓与止血过程中的生物功能。方法利用质粒pCMV3（编码GPIbαH1-V289）设计引物,构建pQE30-GPIbα（H1-V289）表达载体,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA琼脂糖层析柱不同pH值梯度淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,并观察重组蛋白对瑞斯托霉素和ADP诱导血小板聚集的影响。结果成功获得纯度较高的重组GPIbα（H1-V289）蛋白,浓度为0.6 mg/ml。Western blot检测结果显示,抗GPIbα单抗SZ2能在34 kd区域显示条带。而且纯品能有效抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,对ADP诱导的反应无抑制作用。结论重组蛋白具有较好的免疫原性和生物活性,并可以大量获得,为开发抗血栓药物奠定了基础。     

载脂蛋白H单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备及鉴定载脂蛋白H Aport单克隆抗体。方法从人血清中分离纯化Aport免疫小鼠后取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选出两株杂交瘤细胞株2C5和3H4，制备腹水后，用硫酸胺沉淀等方法纯化。获得Aport单抗。结果两株细胞产生的单抗皆属于IgG1，与其它载脂蛋白无交叉反应，细胞株连续传代3个月仍能稳定分泌Aport单抗，且效价稳定。结论2C5和3H4两株细胞能分泌合格的Aport单抗。     

酵母表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的初步纯化

目的：研究酵母表达中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）的纯化方法。方法：表达上清用（NH4）2SO4盐析、凝胶过滤、阳、阴离子交换层析等方式进行纯化。通过比较产品纯度、收率与质量确定最佳实验方案。纯化产品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、等电聚焦与高效液相色谱进行鉴定。结果：获得较高纯度的NGAL。结论：（NH4）2SO4盐析、凝胶过滤和阳离子交换是纯化酵母表达NGAL的最佳实验方案。     

TAP系统分离纯化MT1-MMP-hTAP融合基因蛋白复合物及表达效应评估

目的应用TAP系统分离纯化的MT1-MMP-hTAP蛋白复合物的表达效应.方法应用TAP系统分子生物学特性采用IgG和钙调蛋白亲和胶粒二次亲和层析法分离纯化MT1-MMP-hTAP蛋白复合物.PAP免疫染色及Western blot法检测蛋白表达效应.结果 PAP免疫染色显示MT1-MMP-hTAP融合基因在鸡成纤维细胞内有效表达,融合蛋白染色呈深蓝色,Western blot法检测经TAP系统分离纯化后MT1-MMP-hTAP蛋白复合物分子稳定表达在相应68×103位置.结论 TAP系统分离纯化MT1-MMP-hTAP蛋白复合物及其在动物细胞的构建成功并有效表达为在人类肿瘤细胞建立TAP纯化蛋白质体系和寻找MT1-MMP-hTAP相互作用蛋白提供了方法学支持.     

人呼吸道合胞病毒不同纯化方法的比较研究

目的比较人呼吸道合胞病毒(HRSV)的2种纯化方法。方法 HRSV经超滤浓缩后,分别采用蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法纯化。对纯化产物进行感染性效价、SDS-PAGE还原电泳分析及Western blot检测,并取目的产物免疫ICR小鼠,检测免疫血清的中和抗体效价。结果经还原电泳,蔗糖密度梯度离心和Sepharose 4FF凝胶过滤层析的纯化产物都在60~70kDa间呈现一主要条带,前者证实为HRSV特异性F蛋白;但在Sepharose 4FF凝胶过滤层析3个样品(第2峰)中检测出目的病毒,感染性效价分别为4.50、4.25和6.25 lgCCID50/ml。两种方法所得纯化产物免疫ICR小鼠均能诱导产生中和抗体,几何平均效价(GMT)为1∶13.93~1∶4.00。含铝佐剂组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是不含铝佐剂组的1.5~2.0倍和1.0~1.4倍。β-丙内酯灭活组的抗体阳性率和中和抗体GMT分别是甲醛灭活组的1.0~1.3倍和1.0~1.1倍。结论蔗糖密度梯度离心法和Sepharose 4FF凝胶过滤层析法均能纯化出HRSV,后者效果更好、效率更高。加铝佐剂有助于提高抗体阳转率;β-丙内酯和甲醛2种灭活剂对免疫效果的影响差异不大。     

LpB：E标准物的制备

用纯化的人ＬＤＬ（ａｐｏＢ）免疫山羊，获得特异性羊抗人ａｐｏＢ抗血清。将用正辛酸、硫酸铵沉淀和Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｇ亲和层析纯化的羊抗人ａｐｏＢＩｇＧ与ＣＮＢｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ共价交联，可制备获得特异性抗体亲和层析柱。将适量的人血清通过该亲和柱，用高ｐＨ缓冲液冲洗后，用低ｐＨ缓冲液洗脱，可获得含ａｐｏＢ的脂蛋白，其中包括了同时含ａｐｏＢ和ａｐｏＥ的ＬｐＢ：Ｅ组分。测定其ａｐｏＥ含量后，该组分可作为测定ＬｐＢ：Ｅ的标准物。     

重组人可溶性突变体BAFF蛋白的制备及生物学活性的鉴定

目的制备高纯度的B细胞活化因子(BAFF)可溶性突变体(smBAFF)蛋白,鉴定其生物学活性。方法重组原核表达载体pET41a/smBAFF在大肠杆菌BL21中经IPTG诱导表达smBAFF蛋白,采用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物,超声碎菌,提取包涵体,Ni2+-NTA亲和层析纯化,复性,鉴定其生物学活性。结果经鉴定表达出相对分子质量为1.7×104的外源蛋白smBAFF,经Ni2+-NTA亲和层析纯化出该重组蛋白,复性后的smBAFF与B细胞具有较高的亲和力,但失去共刺激B细胞增殖的能力,且能竞争性抑制天然sBAFF的作用。结论成功制备具有B细胞结合活性而失去刺激B细胞增殖活性的smBAFF,为以smBAFF为靶向载体在B细胞恶性增殖性和异常活化性疾病治疗研究奠定基础。     

聚焦导析法分离人血清载脂蛋白CⅢ亚型

用密度梯度超速离心法,从混合人血清中分离极低密脂蛋白,经脱脂后再进行聚焦层析分离其中的载脂蛋白。     

人C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白-1高特异性抗体的制备

目的 制备人补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白1（hCTRP1）的特异性抗体.方法 合成了hCTRP1的C端抗原肽并免疫新西兰大白兔,利用亲合纯化色谱柱对抗体进行了纯化.结果 间接ELISA测定表明,抗血清效价达1∶64 000,Western印迹及ELISA验证表明纯化抗体具有很高的特异性.结论 人工合成的hCTRP1抗原肽免疫新西兰大白兔,制备了高效价的抗血清,并纯化制备了hCTRP1特性抗体.     

重组人胰岛素样生长因子-1纯化及其鉴定的研究

目的：利川亲和层析法将家蚕幼虫中高效表达的重组人胰岛素样生长因子(recombinant human insulin—like growth factor-1．rhIGF-1)纯化并鉴定，以得到具有免疫学活性和生物学活性的rhIGF-1生物制品。方法：蚕血淋巴中rhIGF—1初步提纯去除杂质。采用亲和层析法纯化rhIGF-1。以EUSA法测定纯化产物中rhIGF-1含量。用SDS-PAGE和Western—blot分析鉴定rhIGF-1纯度及免疫学活性．4-甲基偶氮唑蓝(tetrazolium salt，MTT)法观察其对MCF-7细胞增殖的影响。结果：纯化后rhIGF-1纯度约为40％，Western blot分析发现，主要纯化产物相对分子质量为7．5ku的成熟hIGF-1．所含非目的产物与hIGF-1无免疫交叉反应。细胞活性刺激实验显示，rhIGF-1纯品对MCF-7细胞有较好的刺激活性．促增殖能力优于来源于大肠杆菌的rhIGF-1产品。结论：蚕血淋巴中的rhIGF-1经亲和层析后初步得到纯化，并显示良好的免疫学活性和生物学活性。     

抗人载脂蛋白E多抗的制备与纯化

利用纯化的人载脂蛋白Ｅ（ａｐｏＥ）作为抗原，常规免疫纯系大耳白家兔，获得高效价、高特异性的抗血清，抗体滴度经ＥＬＩＳＡ法检测达１：１２８００倍稀释度，抗体特异性检验证明抗体只与ａｐｏＥ反应。抗血清经ＰｒｏｔｅｉｎＡ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ－４Ｂ亲和层析纯化，分离为碱性洗脱峰Ⅰ和酸性洗脱峰Ⅱ，峰Ⅱ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测在分子量为２７ｋｄ和５４ｋｄ处呈现两条带，分别相当于抗体的重链和轻链的分子量，证明峰Ⅱ为纯化的抗体，这就为建立测定人血清ａｐｏＥ浓度的免疫学方法奠定了基础。     

人宫颈癌传代细胞Ig样蛋白的纯化分析

目的:探讨非造血系统来源的恶性肿瘤细胞内Ig样蛋白与Ig分子在抗原性及分子结构上的关系.方法:应用亲和层析的方法将HeLa MR(人宫颈癌传代细胞)细胞内Ig样蛋白进行了纯化;并以SDS-PAGE及Western Blot方法将Ig样蛋白与IgG进行比较分析.结果:SDS-PAGE结果显示Ig样蛋白既有与IgG相近的轻、重链泳带,同时又分别在相对分子质量6 600、7 000左右出现两条泳带,此两条泳带与人IgG具有高度一致的抗原性.Western Blot结果显示,Ig样蛋白与IgG相同,不但可与抗人IgG多克隆抗体、单克隆抗体反应而且可与Protein A蛋白发生反应.结论:Ig样蛋白与IgG比较在抗原性上具有明显的一致性,而在分子结构上也表现明显相似性,但二者不完全相同.     

人组织激肽释放酶结合蛋白的纯化及特性的研究

作者首次从人血浆中提纯了一种新发现的蛋白质——组织激肽释放酶结合蛋白(KBP),并对其某些生化特性作了初步的研究。提纯物的逆相HPLC图谱为一单一蛋白峰,并经魏氏试验鉴定,证明所提纯的蛋白质为组织激肽释放酶结合蛋白。KBP是一种酸性蛋白质,由487氨基酸残基所组成,分子量约54KDa,pI=5.4。纯化的KBP特异地和~(125)I-HUK结合成92KDa的复合物,复合物的形成具有明显的特异性,KBP不能和前激肽释放酶结合。推测KBP可能在合成和分泌的水平上,对组织激肽释放酶的代谢及活性起调节作用。     

水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的纯化及鉴定

目的　纯化及鉴定重组表达的水痘 -带状疱疹病毒 (VZV)糖蛋白 E(g E)。方法　用 IPTG诱导重组载体 p GEX- VZVg E表达融合蛋白 ,并用亲和层析纯化融合蛋白 ;然后用凝血酶酶切融合蛋白 ,并用免疫印迹法检测酶切产物的抗原性。结果　 p GEX- VZVg E的 IPTG诱导表达产物用亲和层析柱去除杂蛋白后 ,获得相对分子质量为 98× 10 3的纯化融合蛋白 ,经凝血酶酶切后得到了相对分子质量大约为 72× 10 3的糖蛋白 E;纯化的融合蛋白和糖蛋白 E均为 SDS- PAGE单点纯 ,并用免疫印迹证明糖蛋白 E具有良好的抗原性。结论　采用亲和层析柱可以有效的纯化重组 VZV糖蛋白 E,从而为 VZV糖蛋白 E的应用研究打下了基础。