大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的:在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子βⅡ型受体胞外区与γ干扰素(rsTGFβRⅡ-IFNγ)融合蛋白.方法:提取大鼠肝脏mRNA,用RT-PCR方法分别扩增sTGFβRⅡ和IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体pSecTag2A,构建pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ重组体,以脂质体转染至CHO细胞,用ELISA及Western印迹法检测rsTGFβRⅡ-IFNγ表达,并检测该融合蛋白的生物学活性.结果:转染pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ的CHO细胞培养上清表达rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性,能拮抗TGFβ1对CCL-64细胞的增殖抑制作用,能抑制TGFβ1诱导的体外培养的HSC活化.结论:本实验构建的pSecTag2A/rsTGFβRⅡ-IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的rsTGFβRⅡ-IFNγ融合蛋白.     

大鼠转化生长因子β型受体胞外区与γ干扰素融合蛋白真核表达载体的构建

目的 :在哺乳动物细胞中表达有生物学活性的大鼠转化生长因子β 型受体胞外区与γ干扰素(rs TGFβR - IFNγ)融合蛋白。方法 :提取大鼠肝脏 m RNA,用 RT- PCR方法分别扩增 s TGFβR 和 IFNγ基因并克隆至同一真核表达载体 p Sec Tag2 A,构建 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ重组体 ,以脂质体转染至 CHO细胞 ,用EL ISA及 Western印迹法检测 rs TGFβR - IFNγ表达 ,并检测该融合蛋白的生物学活性。结果 :转染 p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ的 CHO细胞培养上清表达 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白 ,该融合蛋白具有明显的抗病毒活性 ,能拮抗 TGFβ1对 CCL- 6 4细胞的增殖抑制作用 ,能抑制 TGFβ1诱导的体外培养的 HSC活化。结论 :本实验构建的p Sec Tag2 A/rs TGFβR - IFNγ表达质粒能在哺乳动物细胞中表达具有生物学活性的 rs TGFβR - IFNγ融合蛋白。     

人截断型转化生长因子β受体Ⅱ真核表达载体的构建和表达

目的构建无细胞内段基因的人转化生长因子βⅡ型受体（△TβRⅡ）的真核表达载体pEGFP／△TβRⅡ，转染L02细胞以表达融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，并检测其生物学活性。方法以质粒H2-3FF为模板，用PCR方法扩增得到人转化生长因子βⅡ型受体（TpRⅡ）胞外段和跨膜段的cDNA，将该cDNA克隆到真核表达载体pEGFP-N2上，构建成pEGFP／△TβRⅡ重组质粒。经双酶切和核酸测序鉴定，将该重组质粒转染L02细胞，用倒置荧光显微镜观察融合蛋白EGFP的表达，并检测其生物学活性。结果L02细胞转染pEGFP／△TβRⅡ重组质粒后，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白EGFP的表达，所表达的蛋白能显著减轻TGF-β1对L02细胞G1～S期的阻滞作用。结论成功构建了pEGFP／△TβRⅡ重组质粒，并表达了有活性的融合蛋白EGFP／△TβRⅡ，为进一步探讨其生物学效应奠定了基础。     

血管活性肠肽真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建一种具有生物学活性的血管活性肠肽(VIP)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从小鼠胸腺淋巴细胞中克隆有信号肽序列的VIP cDNA,插入真核表达载体pcDNA3.1,构建含VIP的重组质粒pcDNA3.1-VIP,转染COS-7细胞,用ELISA和Western blot鉴定表达的蛋白,细胞因子释放抑制法测定生物学活性.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为带有信号肽序列的VIP基因;经转染的COS-7细胞表达VIP蛋白,并能有效地抑制巨噬细胞的TNF-α释放.结论:成功构建了能够表达具有生物学活性的真核表达质粒pcDNA3.1-VIP.     

人Flt3配体基因的克隆及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人Flt3配体(Flt3 LIg and,FL),并在CHO细胞中进行表达.方法 从健康人外周血中提取总RNA,通过RT-PCR技术,扩增Flt3配体胞外区cDNA功能性片段,经DNA测序证实后,将得到的片段基因插入pcDNA3.0表达载体,构建了pcDNA3.0-FL真核表达载体;将重组质粒pcDNA3.0-FL转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞克隆,扩大培养,提取细胞总蛋白,用SDS-PAGE分离并Western blotting检测到在相对分子质量约24 000处有一显色条带.结果 FL胞外区cDNA被正确克隆到真核表达载体pcDNA3.0中并在CHO细胞中成功表达.结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-FL并在CHO细胞中成功表达,为FL的相关研究和应用开发奠定了基础.     

结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Rv2389基因真核表达载体.方法:PCR扩增Rv2389基因,测序正确后克隆入真核表达载体pCDNA3.1(-),重组质粒酶切鉴定正确后以阳离子聚合物转染CHO细胞后, 分别以RT-PCR方法检测mRNA表达和间接免疫荧光技术检测目的蛋白的表达.结果:构建了重组质粒pCDNA- Rv2389, RT-PCR结果证明Rv2389可在CHO细胞中转录,间接免疫荧光检测证明,表达有Rv2389蛋白的细胞着染.结论:成功构建了结核分枝杆菌Rv2389基因的真核表达载体pCDNA-Rv2389,Rv2389基因可以在CHO细胞中表达.     

人ICOS-Ig融合蛋白的真核表达及其生物学活性

目的:真核表达人ICOS胞外区与IgG Fc融合蛋白,并对其生物学活性进行初步分析。方法:以RT-PCR方法克隆人ICOS胞外区片段和人IgG Fc片段,定向插入真核表达载体pSecTag2,构建重组质粒pSecTag2-ICOS-Ig,脂质体转染CHO细胞,可溶性表达并纯化ICOS-Ig融合蛋白。采用SDS-PAGE、蛋白质印迹、ELISA对融合蛋白进行鉴定,配体结合活性实验和混合淋巴细胞增殖反应实验检测融合蛋白的活性。结果:构建的ICOS-Ig融合蛋白表达载体在CHO细胞中表达ICOS-Ig蛋白。纯化获得的ICOS-Ig可以与配体ICOSL特异性结合,并抑制同种T淋巴细胞增殖反应。结论:成功构建了人ICOS胞外区与人IgG Fc融合蛋白真核表达系统,获得有生物学活性的ICOS-Ig融合蛋白。     

LTβR-Ig融合蛋白的真核表达及其体外生物学功能的研究

目的 为了研究LTβR-Ig的生物学功能,构建重组的LTβR-Ig/pcDNA3.1（＋）真核表达载体,在CHO细胞中表达,无血清扩大培养,并初步研究了融合蛋白LTβR-Ig的体外生物学活性。方法 将鼠LTβR胞外段cDNA与人IgG1 Fc段cDNA共同克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,转染CHO-K细胞表达,阳性克隆进行无血清培养,采用PtoteinA亲和层析的方法进行纯化;3[H]TdR参入法检测对细胞增殖的影响。结果经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序,结果 表明克隆了正确序列的LTβR胞外段序列,成功构建了重组表达质粒LTβR-Ig/pcDNA3.1,并在CHO细胞中稳定表达了LTβR-Ig的融合蛋白,证明LTβR-Ig融合蛋白能抑制混合淋巴细胞反应。结论 本研究建立了能稳定表达有生物活性的LTβR-Ig融合蛋白的真核表达系统,为今后研究LTβR在移植排斥中的作用机制,及开展基因重组药物进行疾病的生物治疗奠定了基础。     

稳定表达犬转铁蛋白受体CHO细胞系的建立和鉴定

目的 构建犬转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）的真核表达载体,转染中国仓鼠卵巢CHO细胞,建立稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。方法 从犬腺细胞系（WRD）提取总RNA,逆转录合成 cDNA,采用PCR方法扩增TfR 基因,将其克隆至真核表达载体pCDNA3,酶切和测序鉴定;利用脂质体法转染CHO细胞,通过RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR的表达。结果 构建的pCDNA3-TfR 重组质粒经过酶切和测序鉴定,TfR 基因序列成功插入到pCDNA3载体,且无突变。转染CHO细胞后,RT-PCR、Western blot 及免疫荧光法检测TfR表达阳性,成功建立了稳定表达犬TfR的CHO-TfR 细胞系。HTH]结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3-TfR ,并获得了稳定表达TfR的CHO-TfR 细胞系。     

人PSMP重组蛋白在CHO细胞中表达、纯化及功能鉴定

目的:构建新的具有趋化作用的人类细胞因子PSMP的真核表达载体,在仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)中表达并纯化,为PSMP的功能机制研究奠定基础.方法:从pcDNA3.1-PSMP-myc/His中切下PSMP-myc/His片段,插入pMH3表达载体.利用电穿孔法将该表达载体转染CHO细胞,G418抗性筛选稳定克隆株.以Dot blot及Western blot法检测上清液中PSMP蛋白的表达,利用有限稀释法对抗性筛选出的混合克隆单克隆化,悬浮无血清大批培养工程细胞,通过镍亲和层析法纯化蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度,Boyden小室体外趋化实验分析蛋白功能活性.结果:PSMP-myc/His基因插入pMH3载体后成功构建真核表达载体pMH3-PSMP,转染CHO细胞后经2次克隆化获得稳定表达PSMP的基因工程细胞株.镍亲和层析纯化的重组蛋白PSMP纯度达95％以上且具有生物学活性.结论:成功构建了PSMP蛋白的真核表达载体,并获得其稳定表达的CHO细胞株,获得了较高纯度的、具有生物学活性的重组蛋白,为下一步PSMP功能和机制研究提供有用工具.     

小鼠VCAM-1真核表达质粒的构建及表达

目的:构建小鼠血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)基因真核表达质粒,了解该质粒是否能在真核细胞中有效表达.方法:以小鼠胚肝组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增小鼠VCAM-1全段基因cDNA,应用基因工程技术将扩增的cDNA片段插入pcDNA3.1( )真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染CHO细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果:成功扩增了小鼠VCAM-1全长基因cDNA,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-mVCAM,Western Blot方法证实该质粒能在CHO真核细胞中正确表达目的蛋白.结论:成功构建了小鼠VCAM-1基因的真核表达质粒载体,为进一步研究VCAM-1的新功能和免疫治疗奠定了基础.     

TGF-βRⅡ/Fc融合基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建TGF-βRⅡ/FC融合基因的真核表达载体pIg-TRⅡ，使其在中国仓鼠肾细胞（CHO）中呈分泌性表达，为肺间质纤维化基因治疗的研究奠定基础。方法 采用RT-PCR方法从正常人肺组织中扩增出目的基因TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，再将TGF-βRⅡcDNA片段亚克隆到pIg真核表达载体，该载体在其多克隆位点下游含有人IgG1Fc基因组片段，由此可形成TGF-βRⅡ/FC融合基因；采用脂质体转染技术转染CHO细胞使其瞬时表达融合蛋白；应用细胞免疫荧光技术检测融合蛋白的表达；采用免疫沉淀的方法检测CHO细胞培养上清内融合蛋白的表达。结果 DNA测序结果在Blast上作同源性比较证明插入片段就是TGF-βRⅡcDNA的胞膜外部分，细胞免疫荧光染色呈阳性反应，CHO细胞培养上清内检测到融合蛋白的表达。结论 pIg-TRⅡ真核表达载体构建成功，并能够在CHO细胞中分泌性表达有活性的融合蛋白TGF-βRⅡ/FC。     

重组鼠骨形态发生蛋白7真核表达载体的构建及在心肌细胞中的表达

目的:构建重组鼠骨形态发生蛋白7(BMP-7)的真核表达载体,并观察其在原代培养乳鼠心肌细胞中的表达情况。方法:将RT-PCR法获得的重组鼠BMP-7cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,在FuGENE6.0介导下转染差速贴壁法体外培养的乳鼠心肌细胞,72h后分别应用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting检测mRNA和蛋白水平的表达情况。结果:经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pcDNA3.1-BMP-7;通过RT-PCR、免疫细胞化学法和Western blotting证明pcDNA3.1-BMP-7能有效转染心肌细胞并表达BMP-7蛋白。结论:应用pcDNA3.1载体系统可有效转染重组鼠BMP-7,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。     

小鼠B7-H4重组蛋白的表达及鉴定

目的:构建小鼠B7-H4胞外区基因的真核表达载体,转染酵母细胞以表达mB7-H4,并检测其生物学活性.方法:以mB7-H4的重组质粒为模板,在克隆引物上加入Xho I和EcoR I酶切位点,并用PCR方法扩增得到mB7-H4胞外区的基因片段,经Xho I和EcoR I双酶切后接入酵母表达载体Ppic9上,构建成Ppic9-mB7-H4重组质粒.经双酶切和核酸测序鉴定,将该重组质粒转染至酵母细胞,用PCR、Western Blot及ELISA等方法检测重组基因的表达,并鉴定表达蛋白的生物学活性.结果:转染Ppic9-mB7-H4重组质粒的酵母细胞内表达mB7-H4,诱导表达的mB7-H4能有效抑制CD3单抗活化的T淋巴细胞的增殖(相对抑制率为28.3%)和IL-2(相对抑制率为68.8%)、IL-4(相对抑制率为78.8%)、IL-10(相对抑制率为67.6%)、IFN-γ(相对抑制率为77.7%)等细胞因子的分泌.结论:成功构建了mB7-H4真核表达系统,并获得了有生物学活性的mB7-H4分子.     

基因转染3T3细胞的hTGFβ1表达

目的鉴定重组pcDNA3.1-TGFβ1载体在真核细胞中的表达,为其在软骨组织工程中的基因转染创造条件.方法利用脂质体Fugene 6将TGFβ1真核表达载体转染至NIH3T3细胞,RT-PCR、ELISA检测hTGFβ1基因的表达,并利用CCL/64细胞株鉴定重组hTGFβ1的生物学活性. 结果质粒转染3T3细胞后,hTGFβ1mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且分泌表达的hTGFβ1能明显抑制CCL/64细胞的生长结论重组载体在3T3细胞中能表达具有一定生物学活性的hTGFβ1。     

髓系细胞触发受体-1真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建髓系细胞触发受体-1(TREM-1)的真核表达质粒.方法:利用RT-PCR从人外周血总RNA中扩增TREM-1 基因的全长cDNA,插入克隆载体pUCm-T,BamH I和Pst I,酶切后将目的片段插入真核表达载体pEGFP-C3,构建含有TREM-1的重组质粒pEGFP-TREM-1,转染293细胞,用荧光显微镜观察、Western-blot鉴定蛋白表达.将pEGFP-TREM-1重组质粒转染THP-1细胞,100 ng/ml LPS刺激24 h后,半定量RT-PCR检测TNF-α和IL-1β基因的 mRNA水平.结果:经酶切和基因测序证实,克隆的基因片段为TREM-1基因;经转染的293细胞在荧光显微镜下可见荧光,并能表达TREM-1蛋白;重组TREM-1蛋白具有生物学活性,能增强TNF-α和IL-1β基因的mRNA水平.结论:成功构建了能够表达TREM-1的真核表达质粒pEGFP-C3-TREM-1,为进一步研究该基因的功能奠定了实验基础.     

人phb1基因在哺乳动物细胞株中的转染定位和表达

目的 构建带Flag标签的phb1真核表达载体,将其转染至COS7细胞中观察phb1蛋白在细胞内的定位,并转染至HEK293T细胞检测其表达.方法 以含人phb1全长cDNA序列的质粒pLenti6-phb1为模板,用PCR方法扩增phb1全长序列,连接至T载体,构建pUCm-T-phb1,Kpn Ⅰ和EcoR I双酶切后插入真核表达载体pCDNA3中,将重组表达质粒pCDNA3-Flag-phb1转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.转染至HEK2931、细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测.结果 经测序鉴定,成功构建了真核表达载体pCDNA3-Flag-phb1,转染后荧光显微镜观察phb1在COS7细胞中主要定位于胞质;经Western blot检测phb1基因在HEK293T细胞中能够有效表达.结论 实验结果为进一步了解phb1的功能打下了基础.     

小鼠CD160胞外段真核表达载体的构建和表达

目的 构建小鼠CD160胞外段的真核表达载体,并稳定转染CHO细胞进行真核表达.方法 从C57BL/6小鼠脾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增CD160胞外段,然后将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1和pEGFP-N1两种质粒中,构建重组质粒psCD160和pEGFP-sCD160.重组质粒经双酶切鉴定及测序正确后,用脂质体转染CHO细胞,并用RT-PCR和Western blot检测CD160胞外段的表达,流式细胞术检测重组psCD160与其配体的结合能力.结果 获得长度约为520 bp的小鼠CD160胞外段基因,经测序证实其序列正确.用脂质体将含有CD160胞外段基因的重组质粒载体转染CHO细胞后.RT-PCR和Western blot分析证实转染的CHO细胞可表达重组的psCD160基因,并且表达的可溶性CD160可与其配体结合.结论 成功构建小鼠CD160胞外段基因的真核表达载体,并转染CHO细胞后表达出相应蛋白,为进一步研究CD160胞外段的功能效应奠定实验基础.     

VEGF—C真核表达载体的构建和体外表达

目的：构建血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因的真核表达栽体，检测其在真核细胞CHO中的表达。方法：根据人VEGF—C cDNA的序列，设计合成一对特异性引物，用RT—PCR法克隆乳腺癌细胞MCF-7VEGF—C基因的cDNA，回收PCR产物连接于克隆载体。扩增，质粒提取，酶切鉴定并进行基因序列鉴定。酶切回收VEGF—C cDNA全长的基因片段，与真核表达栽体pcDNA3．1(-)连接重组质粒进行酶切鉴定。采用脂质体转染法将构建的pcDNA3．1(-)，VEGF-C转染至CHO细胞中，G418加压筛选培养。最后用Westerm—blotting法检测细胞培养上清以及裂解细胞中的VEGF-C蛋白。结果：基因测序证实RT-PCR产物包含VEGF-C cDNA全长。重组peDNA3．1(-)中含 有VEGF—C cDNA全长序列，Westem—blotting检测到细胞培养上清中以及细胞内有VEGF-C蛋白存在。结论：成功构建了人类VEGF-C真核表达载体并检测到载体在真核细胞中的表达。     

人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达

目的 构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1.观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达.方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒.用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Western blotting实验观察重组质粒的表达情况.结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1 cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1 cDNA序列一致.经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Western blotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达.结论 成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础.