合成肽抗原ELISA检测丙型肝炎病毒核心抗体实验条件的初步探讨

自1989年获得丙型肝炎病毒(HCV)克隆并测出HCV RNA的大部分核苷酸序列以来,相继建立了HCV抗体测定和聚合酶链反应(PCR)检测HCV RNA的方法,使丙型肝炎的病原诊断取得突破性进展。目前所采用的重组抗原建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)和重组免疫印迹法(RIBA)检测抗HCV存在着感染早期检出率低、试     

基因扩增技术诊断隐原性肝硬化中HCV和HBV感染

应用聚合酶链反应检测35例隐原性肝硬化的血清HCV RNA和HBV DNA,结果两项标志共检出27例,总阳性率77.1％。其中,单项HCV RNA阳性占28.6％(10/35);单项HBV DNA阳性占25.7％(9/25);HCV RNA和HBV DNA双阳性占22.9％(8/35)。表明本地区隐原性肝硬化的发生多与HCV和/或隐匿性HBV感染有关。     

聚合酶链反应检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸的研究

本文报道了简便快速检测血清及肝脏中丙型肝炎病毒核糖核酸(HCV RNA)的聚合酶链反应(PCR)方法。检测单浆献血员61例,其中抗-HCV阳性30例,检出血清HCV RNA阳性者17例;抗-HCV阴性31例,检出血清HCV RNA阳性者9例。检测6例血清HCV RNA阴性、抗-HCV阳性丙型肝炎患者的肝穿标本,发现4例HCV RNA阳性。说明本文所建立的PCR方法是诊断HCV感染的特异性强、敏感度高的一种新方法。检测肝组织内的HCV RNA可提高HCV RNA的检出率。本文还对标本的处理及如何避免假阳性等问题进行了讨论。     

两种中药提取物相关成分对HCV聚合酶的作用研究

目的构建HCV聚合酶基因的重组原核表达质粒后,研究了获得高效表达聚合酶蛋白的最适条件,同时摸索表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件,研究建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型使用的HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳浓度,为筛选药物创造条件。方法使用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性病人血清中扩增出HCV NS5b RNA聚合酶全长基因序列,构建了原核表达载体pET30aNS5b等。在多个载体中选取pET-30a作为表达载体,选择各种诱导表达条件。进一步利用Ni2十金属离子螯和亲和层析将其纯化,对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究。利用DNA-BAND培养板96孔板,建立生物素标记检测HCV NS5b聚合酶活性的细胞外分子模型。同时,摸索了聚合酶作用模板以及酶浓度对聚合酶模型的影响的相关条件。结果测序及读码框架分析结果表明得到相关HCV NS5b RNA聚合酶全基因序列,在最佳表达条件下,诱导表达融合蛋白(65×103),得到了纯度大于92.83%的酶蛋白,研究确定了HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件。结论HCV聚合酶的高效表达和有效纯化,以及HCV聚合酶作用模板及酶浓度的最佳条件研究,为建立细胞外丙型肝炎病毒聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。     

乙、丙型肝炎病毒感染与原发性肝癌关系的研究

目的 进一步证实太原地区HCV、HBV感染与原发性肝癌发生的相关性。方法 采用逆转录套式聚合酶链反应（RT-nested PCR）检测74例原发性肝细胞癌患者血清HBV DNA,HCV RNA。结果 肝癌患者血清HBV DNA、HCV RNA及HBV DNA、HCV RNA双阳性者各占63.5%、12.2%及14.9%。其中9.5%的肝癌患者HCV、HBV标志物均为阴性。结论 HBV及Ⅱ型HCV感染在其相关性肝癌的发生中可能起着主导作用。     

255例抗-HCV与HCV RNA定量检测结果比较分析

目的 探讨血清丙型肝炎病毒抗体和核糖核酸检测阳性结果的临床意义。方法 采用第三代试剂药盒ELISA法检测抗-HCV、荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)法检测HCV RNA。结果 抗-HCV阳性／HCV RNA阴性135例(52．94％),抗-HCV／HCV RNA均阳性者99例(38．82％),而抗-HCV阴性／HCV RNA阳性者21例(8．24％)。结论 临床上疑诊丙型肝炎病毒感染的患者在检测抗-HCV的同时,应加做HCV RNA定量检测。     

基因芯片技术检测乙、丙型肝炎病毒临床研究

探讨基因芯片技术在乙、丙型病毒检测的作用。方法 用迈科锐HBV、HCV联合基因芯片检测血清HBV—DNA和HCV—RNA。结果 基因芯片检测42例HBV—DNA的检出率为86％(26／30)，符合率为88％(37／42)，假阳性为8％(1／12)。检测HCV—RNA检出率为71％(5／7)。符合率为92％(39／42)，假阳性为2％(1／35)。结论 HBV、HCV联合基因芯片检测HBV—DNA和HCV—RNA有较好的敏感性和特异性。     

PCR-BHEL技术的建立及对血清中丙肝病毒的检测

目的:探讨聚合酶链反应偶联印迹杂交和酶联放大技术(PCR-BHEL)在检测血液传染性病毒中的优越性。方法:采用PCR-BHEL检测129例抗-HCV阳性和45例抗-HCV阴性的血清标本,并将该项技术与逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的检测结果进行比较。结果:PCR-BHEL检测129例抗-HCV阳性标本的HCV RNA检出率为78.29%,45例阴性标本的HCV RNA检出率为6.67%;采用RT-PCR检测的HCV RNA检出率分别为62.02%和2.22%。PCR-BHEL技术对HCVRNA的检出率高于RT-PCR,差别有统计学意义(P<0.001)。结论:PCR-BHEL较RT-PCR技术的灵敏度高,能够有效地提高HCV RNA的检出率,可推广应用于其他传染性病毒的检测。     

金纳米颗粒基因探针同步检测HBV和HCV的初步研究

目的 建立一种简单、快速同时检测HBV DNA和HCV RNA的诊断方法.方法 利用PCR方法扩增HBsAg阳性合并抗HCV阳性的患者血清中HBV DNA和HCV cDNA并提取.制备Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针.在含有Au纳米颗粒HBV DNA、HCV cDNA基因探针的液相检测体系中加入HBV DNA和(或)HCV cDNA,透射电镜下观察.结果 PCR(可扩增HBV DNA和HCV cDNA.出现预期的431bp和323bp特异性条带.使用Au纳米颗粒基因探针通过透射电镜可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中提取的HBV DNA和HCV RNA.结论 通过透射电镜,使用Au纳米颗粒基因探针可同步检出乙、丙型肝炎合并感染患者血清中的HBV DNA和HCV cDNA,甚至可达到无需PCR水平,此方法具有敏感性高、特异性好的特点.     

丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的进一步研究

为进一步研究外周血单个核细胞 (PBMC)感染丙型肝炎病毒 (HCV)的状况。用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)、地高辛标记 HCV探针作原位杂交和链酶亲和素 -生物素 (SABC)作免疫组化三项技术 ,检测血清和 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5 抗原。结果显示 RT- PCR检测的 2 0例慢性丙型肝炎患者 ,除去 4例接受干扰素治疗者 ,余16例中有 14例 (87.5 % )血清 HCV RNA阳性 ,2例血清 HCV RNA阴性者的 PBMC- HCV RNA阳性。对 RT- PCR检测的 9例 PBMC- HCV RNA阳性患者 ,进一步用原位杂交和免疫组化技术 ,分别检测 PBMC中的 HCV RNA和HCV NS5 抗原。显示这几种方法的检测结果是基本一致的 ,呈正相关关系。患者的 PBMC中的 HCV RNA和 HCV NS5抗原呈散在颗粒状或弥漫分布 ,主要位于胞浆中 ,HCV NS5 抗原还分布于胞膜上。证实 HCV可以感染 PBMC,并在其中复制 ,复制部位在胞浆。     

多重PCR检测HBV和HCV方法的建立

目的:建立可同时检测血清HBVDNA和HCVRNA的多重PCR。方法:利用已知的基因序列设计了对于不同亚型HBV保守的C基因区的一对引物HBV-P623及对于不同亚型HCV高度保守的位于5’端非编码区(5’-NCR)的两对引物HCV-P289和HCV-P174,扩增经基因释放剂(Genereleaser)处理的HBV和HCV阳性血清。结果:多重引物、逆转录套式PCR反应体系可同时扩增HBV DNA和HCV RNA,分别在623bp和174bp处出现特异DNA扩增带。该反应体系具有较高的特异和敏感性,受检血清中仅含有10fgHBV DNA和5CID HCV RNA即可检出。血清标本不需要提取核酸,可直接进行PCR。用此体系检测30例输血后病人血清,其中15例为HBV感染,8例为HCV感染,7例为阴性。结论:多重PCR检测HBV及HCV的方法具有简便性和实用性。     

丙型肝炎宫内传播的临床研究

目的 了解丙型肝炎病毒(HCV)的宫内感染情况。方法 对54例抗HCV和／或HCV RNA阳性孕妇之55例新生儿(其中1例为双胞胎)的脐静脉血进行研究：孕妇平均年龄25岁，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录一一聚合酶链反应法分别检测新生儿脐静脉血中抗HCV和HCV RNA的量。结果 抗HCV阳性，而HCV RNA阴性的孕妇其宫内感染机率很低。而HCV无论阳性或阴性，只要HCV RNA阳性孕妇，其宫内感染率可达100％，转氨酶(ALT)升高的孕妇，其新生儿ALT也明显升高。结论 HCV RNA阳性孕妇必有宫内感染，而抗HCV阳性。HCV RNA阴性孕妇也有宫内感染的可能。     

联合运用RT-PCR与DELFIA技术检测丙型肝炎病毒结果分析

目的探讨丙型肝炎病毒(HCV)抗体、HCV RNA联合检测用于丙型肝炎诊断的临床价值,并研究本地区丙型肝炎的感染和流行情况.方法采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HCV RNA、解离-增强时间分辨荧光免疫分析法(DELFIA)定量检测HCV抗体.结果715例初诊为丙型肝炎的患者中,HCV抗体阳性85例(11.89%),HCV RNA阳性107例(14.96%),两者共同阳性76例(10.63%),其中男性49例(64.47%),女性27例(35.53%),主要集中在35-45岁之间.结论单独检测HCV抗体或HCV RNA均有一定的缺陷,二者联合检测可提高丙型肝炎的检出准确率;RT-PCR技术灵敏度较高,对HCV RNA检出率较高.丙型肝炎在门诊就诊者中阳性检出率较高,且以中青年为主,男女性别感染检出率无差异.     

PCR-微流芯片在血液HBV DNA HCV/HIV RNA筛查中的初步应用

目的探讨在血液筛查中应用PCR-微流芯片技术检测献血者HBV DNA,HCV/HIV RNA的模式及可行性。方法在常规ELISA初、复检全项测定合格基础上,将献血者的血清按5人份×200μL进行汇集,用大容量磁珠法提取样本核酸,PCR-微流芯片检测技术进行扩增和检测。将国家标准质控血清进行系列稀释考评方法的灵敏度和重复性。结果342份(69个汇集池)无偿献血标本中有3份HBsAg(-)HBV DNA( ),HBV DNA阳性率为0.89%,其中1份标本两对半结果全阴性,2份标本抗-HBs( )及抗-HBc( )。PCR-微流芯片法检测HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA的95%的灵敏度分别为11.5IU/mL、167.7拷贝/mL和57.9IU/mL结论PCR-微流芯片法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好特点,可应用于血液HBV DNA HCV/HIV RNA的筛查工作,以进一步提高输血的安全性。     

母婴间TTV、HBV和HCV的重叠感染

目的 :探讨母婴间 TTV、HBV和 HCV重叠感染的分布及感染率。方法 :对 1 40例产妇及新生儿血清应用聚合酶链反应 ( PCR)、反转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)检测 TTV、HBV和 HCV感染的阳性率。结果 :HBV- DNA及 HCV- RNA双重阳性产妇的新生儿双重阳性率为 1 0 0 % ,HBe Ag阳性产妇的新生儿 HBe Ag阳性率为 82 % ,抗 - HCV阳性产妇的新生儿阳性率为 75 % ,HBe Ag阳性并发 TTV阳性产妇的新生儿阳性率为 73% ,HCV并发 TTV阳性产妇的新生儿阳性率为 66.6%。结论 :母婴间存在 TTV并发 HCV、HCV双重感染     

核酸检测技术在血液筛查中的应用研究

目的大样本、多方法调查深圳地区无偿献血人群中乙肝、丙肝和艾滋病病毒血清学阴性者的核酸阳性率,探讨在我国血液筛查中引进核酸扩增技术的必要性,了解和分析献血者血清学阴性核酸阳性感染状况。方法采用大样本数调查,应用ROCHE PCR-ELISA、PCR-微流芯片、实时荧光PCR方法和CHIRON TMA(转录依赖的扩增技术)多种方法对血清学检测阴性的献血者进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1RNA检测,对乙肝阳性献血者追踪检测ALT和乙肝两对半标志物,对丙肝核酸阳性献血者追踪检测ALT及抗-HCV及HBV DNA和HCV RNA病毒载量。结果共对141288人份血样进行了检测,检出HBsAg(-)、HBV DNA阳性28例,总阳性率为0.020%,其中21例为anti-HBc阳性,占0.015%。HIV-1RNA未检出阳性,17例HBsAg(-)、HBV DNA阳性样本追踪发现,9例发生了血清转换现象,4例呈窗口期特征,所有追踪的HBV DNA阳性献血者ALT检测结果正常。1例anti-HCV(-)、HCV RNA阳性献血者追踪发现为典型窗口期献血,ALT显著升高。结论应采用高灵敏度的核酸扩增技术筛查血液中的乙肝和丙肝病毒,可提高血液安全。     

初乳中检测HCV-RNA的意义

目的　探讨丙型肝炎病毒通过母乳传播的可能性。方法　对 2 2例丙肝血清学标志阳性母亲产后 1～ 3天内的乳汁 ,采用聚合酶链反应 (PCR)技术检测HCV RNA。结果　丙型肝炎血清学标志阳性组乳汁中HCV RNA检出率为 18 2 %。结论　乳汁HCV RNA阳性者具有传染性 ,通过哺乳有可能导致婴儿感染HCV ,而不宜哺乳。     

荧光定量PCR在丙型肝炎病毒感染检测中的应用

目的　观察荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)在丙型肝炎病毒 (hepatitisCvirus ,HCV )感染检测中的临床应用情况。方法　用FQ PCR检测 3 15份怀疑HCV感染的临床血清标本 ,并同时采用酶联免疫吸附测定法 (ELISA)检测抗HCV ,用生化仪测定血清丙氨酸氨基转移酶 (ALT)水平 ,了解样本中HCV RNA含量与抗HCV及ALT的相关性。结果　 3 15份标本中有 2 2 5份HCV RNA含量高于 80拷贝·ml-1,2 5 0份抗HCV阳性 ,14 5例ALT异常 ,HCV RNA含量与抗HCV阳性率间有显著的相关性 (r =0 .682 ,P =0 .0 0 2 ) ;HCV RNA含量与ALT异常率间也有显著的相关性 (r =0 .92 3 ,P =0 .0 3 2 )。结论　FQ PCR技术检测HCV RNA特异性强 ,灵敏度高 ,具有良好的临床应用价值。     

血透患者血清庚型肝炎病毒RNA及抗体检测

目的:了解血透患者庚型肝炎病毒(HGV)感染率及与其他肝炎病毒重叠感染的情况。方法:收集57份血透患者血清标本,根据HGV RNA保守片段5′非编码区序列,设计了两对引物,采用逆转录巢式PCR扩增HGV RNA,以及EIA法检测HGV IgG抗体。同时还检测了HBV DNA及HCV IgG抗体。结果:57份标本中,4份HGV RNA阳性(7.0％),2份HGV IgG抗体阳性(3.5％)。HGV RNA与HGV IgG抗体呈“分离”现象。4份HGV RNA阳性标本中2份为HBV DNA阳性,2份为HCV IgG抗体阳性;其中1份标本HBV DNA和HCV IgG抗体均为阳性。结论:血透患者HGV感染率高于健康献血员和正常人群,HGV可与HBV和HCV重叠感染。