fgl2凝血酶原酶多肽抗体的制备和应用

目的　利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源fgl2凝血酶原酶 (hfgl2、mfgl2 )的特异性多克隆抗体 ,以期用于与fgl2表达异常密切相关的疾病的研究和诊治。方法　根据mfgl2、hfgl2基因编码的氨基酸序列合成多肽 3(Pep3)和多肽 4 (Pep4 ) ,并用化学方法与匙孔血蓝蛋白 (KLH)连接 ,纯品Pep3 KLH和Pep4 KLH免疫动物 ,所制备的抗血清用ELISA、Westernblot和前凝血质活性 (PCA)实验鉴定 ,并采用免疫组化法应用于乙型肝炎患者肝组织中hfgl2的检测。结果　ELISA检测表明 ,所制备的抗血清可分别与Pep3和Pep4发生特异性免疫反应 ;Westernblot结果显示 ,抗血清可识别MHV 3感染BALB cJ小鼠腹腔巨噬细胞特异性条带 ,相对分子质量 (Mr)为 6 5× 10 3;PCA实验提示 ,抗血清具有中和mfgl2分子酶活性的作用。对病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hfgl2仅在重型乙型肝炎患者高表达 ,而在慢性乙型肝炎和肝硬化患者的肝组织中无表达。结论　所制备的fgl2的多肽抗体 (多克隆抗体 )可识别mfgl2和hfgl2分子 ,具有与抗原特异性结合、中和其酶活性的特征 ,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段。     

Detection of HBV and HCV Coinfection by TEM with Au Nanoparticle Gene Probes

Gold(Au) nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes were prepared and were used to detect HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection directly by transmission electron microscopy(TEM).PCR identifying HBV and HCV in serum of patients with HBV and HCV coinfection was established.Alkanethiol-modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes through covalent binding of Au-S.HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection was added to the detection system composed of nanoparticle HBV DNA and(or) HCV cDNA gene probes.The results showed that HBV DNA and HCV RNA could be specifically amplified by PCR.The zones of DNA amplification appeared in 431 bp and 323 bp respectively.When HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection were added to the detection system,TEM displayed the nanoparticles self-assembled into large network aggregates.It was concluded that the detection of HBV and HCV coinfection by TEM was convenient and efficient with high specificity and sensitivity.     

恶性肿瘤组织中人纤维介素的表达及作用

目的研究恶性肿瘤患者病理组织中人纤维介素（human fibrinogen-like protein2，hfgl2）的表达及与纤维蛋白沉积的关系。方法采用免疫组化方法检测了11例结肠癌、15例宫颈癌、10例乳腺癌、9例食管癌、12例肺癌、16例胃癌患者的病理组织切片中hfgl2及纤维蛋白的表达，分析二者的组织学关系，用RT-PCR方法检测了部分肿瘤组织与肿瘤细胞系中的hfgl2 mRNA。结果免疫组化显示hfgl2在上述肿瘤中均有表达，主要分布于间质浸润细胞、肿瘤实质细胞、肿瘤血管内皮细胞及细胞外基质，且在邻近有明显的纤维蛋白沉积。通过RTPCR，在体外培养的数种肿瘤细胞系中未检出hfgl2 mRNA，但在肿瘤组织中检出hfgl2 mRNA表达明显高于正常组织。结论恶性肿瘤时存在hfgl2的高表达，并且可能与肿瘤高凝状态的形成及肿瘤的演进有关。     

腺病毒载体在小鼠肝脏的分布及其表达规律研究

目的研究腺病毒载体介导的β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因在小鼠肝脏的分布及表达情况,评价腺病毒载体作为基因治疗转导系统的有效性及安全性,为进一步的目的基因导入及表达奠定基础。方法将Balb/cJ小鼠随机分为正常组及暴发性肝炎组,给小鼠经尾静脉注射2×108PFU腺病毒,收集24h、48h、72h、96h、120h和第7天小鼠血清,检测谷丙转氨酶和总胆红素,同时取肝脏、肺脏、心脏、肾脏标本进行X-gal染色,以观察腺病毒载体在各脏器的表达情况。取MHV-3诱导的暴发性肝炎组小鼠24h、48h、72h、96h肝脏,检测腺病毒载体在肝脏的表达情况。结果腺病毒载体主要在小鼠肝脏表达,并于72小时表达最高,在正常小鼠及暴发性肝炎小鼠肝脏中表达效率分别约55.7%和25.7%,之后逐渐消减;正常组小鼠注射腺病毒载体后,肝功能无明显变化。结论腺病毒载体介导的报告基因可在肝脏高效表达且未见明显的肝损害,可作为基因治疗中安全有效的基因传递系统用于治疗肝脏疾病。     

应用人类全基因组寡核苷酸芯片筛查自身免疫性肝炎相关基因

为研究自身免疫性肝炎发病过程中基因表达改变与免疫反应的关系,我们采用人类全基因寡核菅酸芯片筛查自身免疫性肝炎差异表达基因,并对结果进行聚类分析,筛选出与疾病关系最密切的基因功能群,为进一步阐明发病机制,寻找致病基因提供参考。     

KCTD9多肽抗体的制备和应用

目的:利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源KCTD9(hKCTD9、mKCID9)的特异性多克隆抗体,以期用于与KCTD9表达异常密切相关疾病的研究和诊治.方法:根据hKCTD9、mKCTD9基因编码的氨基酸序列合成多肽(Pep),并用化学方法与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接,纯品Pep-KLH免疫纯种新西兰雄性大白兔,所制备的抗血清用ELISA、Western blot实验鉴定,并采用免疫组化法应用于正常人和乙型肝炎患者肝组织中hKCTD9的检测.结果:ELISA检测表明,用Pep-KLH免疫的大白兔所制备的抗血清可与Pep发生特异性免疫反应;Western blot结果显示,抗血清可识别MHV-3感染BALB/cJ小鼠PBMC特异性条带,相对分子质量(Mr)为37 KD.对正常人和病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hKCTD9在正常人和重型乙型肝炎患者均有表达,但是在重型乙型肝炎患者高表达.结论:所制备的KCTD9的多肽抗体(多克隆抗体)可识别mKCTD9和hKCTD9分子,具有与抗原特异性结合,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段.     

自身免疫紊乱和重症肝病

病毒性肝炎的发生发展或自身免疫性肝病与自身免疫紊乱相关，自身免疫紊乱的进行性加重可致肝病加重。本文拟从分子模拟、凋亡和遗传因素等方面初步探讨自身免疫紊乱机制在重症肝病发展中的作用。     

070 IL-13在哮喘中的作用

支气管哮喘是以Th2型细胞因子增高和气道高反应性为特征的变态反应性疾病.白细胞介素-13(IL-13)是近年来新克隆的Th2型细胞因子,它通过诱导B细胞增殖和分化,促进IgE合成,活化嗜酸性粒细胞,延长嗜酸性粒细胞的存活,诱导气道高反应性等机制,在哮喘的发生中起重要的作用.     

人重型肝炎相关基因Fas、TNFR1真核表达载体和microRNA表达载体的构建及其体外干预效应的初步研究

目的 构建人Fas(hFas)和人TNFR1(hTNFR1)基因的真核表达质粒pcDNA3.0-hFas、pcDNA3.0-hTNFR1和microRNA(miRNA)干扰质粒p-hFasmiRNA、 p-hTNFR1miRNA,初步验证其在体外细胞系对Fas和TNFR1基因表达的干预效应.方法 从人肝癌细胞HepG2细胞中获得模板cDNA,通过PCR扩增出hFas和hTNFR1全长片段,将目的 片段通过T载体过渡克隆至表达载体pcDNA3.0,得到重组质粒pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1.利用miRNA设计软件,针对Fas和TNFR1基因分别设计3对pre-microRNA(pre-miRNA)序列,通过T4连接酶将pre-miRNA克隆至pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA表达载体,同时构建非相关干扰质粒.构建成功的p-hFasmiRNA1、p-hFasmiRNA2、p-hFasmiRNA3和p-hTNFR1miRNA1、p-hTNFR1miRNA2、p-hTNFR1miRNA3分别与pcDNA3.0-hFas和pcDNA3.0-hTNFR1共转染至人293T细胞,通过Real-time PCR和Western blot检测转染48 h后对基因表达的干预效应.结果通过测序鉴定表明Fas和TNFR1基因的真核表达载体和miRNA干扰质粒均构建成功. Real-time PCR结果显示干预组的Fas和TNFR1基因的表达与对照组比较明显减少,抑制效率分别可达到87%和80%.Western blot结果也同样证实干预组的Fas和TNFR1基因的蛋白表达量与对照组比较明显减少.结论 成功构建了hFas和hTNFR1的真核表达载体和microRNA干扰质粒,并初步证实构建的microRNA干扰质粒在细胞水平对hFas和hTNFR1的表达具有特异性的抑制效应.