重组人釉原蛋白真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的稳定表达

目的构建含人釉原蛋白(hAm)基因的重组真核表达质粒并转染哺乳动物细胞NIH3T3,建立稳定表达重组hAm的细胞株,为临床应用奠定基础。方法利用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ将hAm基因插入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)A,构建含hAm基因的重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm,双酶切和测序鉴定。通过LipofectamineTM2000介导重组质粒转染NIH3T3细胞,利用G418筛选出阳性克隆,建立稳定表达人釉原蛋白的细胞株,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting验证蛋白表达。结果重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)A-hAm经双酶切和测序鉴定证实插入序列准确无误。重组质粒转染NIH3T3细胞后建立的稳定转染细胞株经SDS-PAGE电泳及Western blotting检测显示有相对分子质量为28 000的hAm表达,与预测一致。结论成功构建含hAm基因的重组真核表达系统,并获得稳定表达重组hAm的细胞株NIH3T3-hAm细胞株。     

Galectin-3重组真核表达载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的:构建半乳糖凝集素-3(Gal-3)的真核表达载体,在NIH/3T3细胞中表达,并检测其表达?方法:通过DNA重组技术和PCR方法从人肿瘤细胞克隆Gal-3基因,插入真核表达载体pEGFP-N1中,通过酶切和测序鉴定重组载体的正确性;采用脂质体转染技术将重组质粒pEGFP-Gal-3瞬时转染NIH/3T3细胞,经荧光和Western blot方法检测Gal-3表达,MTT法检测Gal-3对NIH/3T3细胞增殖的影响?结果:限制性内切酶鉴定和核酸序列测序证实成功构建含Gal-3的重组真核表达载体pEGFP-Gal-3?以重组质粒瞬时转染NIH/3T3细胞,检测到Gal-3蛋白表达,并证实Gal-3蛋白促进NIH/3T3细胞增殖?结论:成功构建的pEGFP-Gal-3真核表达载体在小鼠NIH/3T3细胞中成功表达,并促进NIH/3T3细胞增殖?     

小鼠24p3基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠24p3基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH3T3细胞中24p3/SIP24蛋白的表达情况,初步鉴定24p3/SIP24蛋白介导铁向细胞内转运的生物学功能.方法RT-PCR自小鼠肺组织中克隆24p3 cDNA.用基因重组技术构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体并行酶切和测序鉴定.脂质体DOTAP方法转染NIH3T3细胞,48 h后用G418筛选阳性克隆并培养扩增至21 d.对阳性克隆的培养基上清中24p3/SIP24蛋白的表达用ELISA和Westernblot分析,进一步用原子吸收分光光谱观察其介导铁向NIH3T3细胞内转运的生物学功能.结果成功克隆24p3cDNA并构建24p3-pcDNA3.0真核表达载体,筛选出稳定表达24p3/SIP24蛋白的NIH3T3细胞株,24p3/SIP24蛋白在NIH3T3细胞上清中获得表达,并能介导铁向NIH3T3细胞内转运.结论24p3基因在NIH3T3细胞中获得表达,有良好的生物学活性,为进一步研究24p3/SIP24蛋白介导铁转运的生物学功能及作用机制奠定了基础.     

人Tim-3基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人Tim-3基因,并构建含有该目的基因的重组真核表达载体,获得稳定表达人Tim-3分子的L929基因转染细胞。方法采用RT-PCR方法从人外周血T淋巴细胞中克隆出Tim-3基因,通过双酶切（XhoI,Sa-lI）装入真核表达载体pIRES2-EGFP中,脂质体法转染L929细胞,72 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达Tim-3蛋白的L929细胞株。结果构建了用于表达的含Tim-3基因的重组真核表达载体,经脂质体转染L929细胞,继而经RT-PCR和流式细胞术表型检测,筛选出稳定表达人Tim-3蛋白的L929转基因细胞。结论构建了含人Tim-3基因重组真核表达载体和稳定表达人Tim-3蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究和单克隆抗体的研制奠定了基础。     

人同种异体移植炎症因子-1的基因克隆及其在小鼠成纤维细胞中的表达

目的构建人同种异体移植炎症因子-1(allograft inflammatory factor-1,AIF-1)基因的真核表达载体并在小鼠成纤维细胞系(NIH3T3)中表达,为进一步研究AIF-1蛋白的功能奠定基础。方法利用基因重组技术,构建带有AIF-1基因的2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1。利用脂质体法将2种重组质粒分别转染NIH3T3细胞,用荧光倒置显微镜及Western blot方法观察及鉴定AIF-1在细胞中的稳定表达及瞬时表达。结果酶切分析及DNA序列测定证实,AIF-1基因片段被分别克隆入真核表达载体pcDNA3.1(-)与pEGFP-C1。荧光显微镜观察到NIH3T3细胞中有绿色荧光分布。Western blot结果表明,转染重组质粒的NIH3T3细胞中,AIF-1表达量明显增高。结论成功构建了2种重组真核表达载体:pcDNA3.1(-)/AIF-1与pEGFP-C1/AIF-1,经转染NIH3T3细胞株获得了AIF-1蛋白的瞬时表达及稳定表达。     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.     

人反义VEGF121 cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121cDNA真核表达质粒，研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法 将VEGFl21反向克隆人真核表达载体pcDNA3中，酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24，G418筛选获得阳性克隆，RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达，ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24．细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121cDNA质粒表达重组质粒。VEGFl21反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达，转染后肿瘤细胞VEGFmRNA和VEGF蛋白表达都明显减少；转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱；形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀，核染色质边集，凝集成块，可见明显的凋亡改变。结论 成功构建了反义VEGF121cDNA真核表达质粒，转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖，为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

p16真核表达载体的构建及其稳定表达的NIH3T3细胞株的建立

目的　构建pCR○R3 1 p16真核表达质粒 ,并建立其稳定表达的NIH3T3细胞株。方法　将人的p16cDNA亚克隆至pCR○R3 1,将该重组质粒转化DH5α感受态大肠埃希菌 ,筛选阳性克隆 ,进行EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定及DNA测序 ,将已鉴定的pCR○R3 1 p16经脂质体介导转染至NIH3T3细胞中。结果　重组质粒双酶切后 ,出现约 80 0bp片段 ,提示p16cDNA片断已插入pCR○R3 1多克隆位点内 ,DNA测序显示p16cDNA按照正确方向和阅读框插入表达载体pCR○R3 1。通过pCR○R3 1 p16转染NIH3T3细胞 ,获得 10个G4 18抗性克隆 ,其中 2个为RT PCR阳性。结论　成功构建pCR○R3 1 p16真核表达载体并建立了其稳定表达的NIH3T3细胞株。为建立p16转基因鼠奠定基础。     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

引入CpG基序的嗜肺军团菌lgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达.方法 采用PCR方法 将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆人真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞.结果 通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpC中lvgA/CpC克隆片段长为657 bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7 Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合.用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达.结论 本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号.     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒，并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法通过RT-PCR的方法．从小鼠肝脏中获得Rantes基因；将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SIh中．构建成重组质粒；重组质粒转入大肠杆菌JM109，筛选出含有正确插入片段的克隆；限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒，并进行DNA序列分析；用脂质体介导法转染NIH3T3细胞，免疫荧光检测重组质粒的表达情况；MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果经过酶切分析及DNA测序证实，Rantes基因正确插入到真核表达质粒SR仅中，并在NIH3T3细胞中表达；MTT法证实，重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRa，该质粒可在真核细胞中瞬时表达．其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。     

一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes真核表达质粒的构建及功能

目的 构建一种新型重组免疫毒素DT390-Rantes的真核表达质粒,并对这种免疫毒素的功能进行初步研究。方法 通过RT-PCR的方法,从小鼠肝脏中获得Rantes基因;将Rantes基因插入到含有DT390片段的真核质粒SRα中,构建成重组质粒;重组质粒转入大肠杆菌JM109,筛选出含有正确插入片段的克隆;限制性内切酶酶切图谱分析重组质粒,并进行DNA序列分析;用脂质体介导法转染NIH3T3细胞,免疫荧光检测重组质粒的表达情况;MTT法测定DT390-Rantes的表达活性。结果 经过酶切分析及DNA测序证实,Rantes基因正确插入到真核表达质粒SRα中,并在NIH3T3细胞中表达;MTT法证实,重组免疫毒素DT390-Rantes能在体外杀伤活化的T细胞。结论 成功地构建了一种新型重组免疫毒素真核表达质粒DT390-Rantes-SRα,该质粒可在真核细胞中瞬时表达,其转染上清对活化的T细胞具有杀伤作用。     

霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达

目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。     

靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

mMIP-1α-DT390重组免疫毒素真核表达载体的构建及表达研究

目的 构建小鼠MIP-1α(mMIP-1α)基因和白喉杆菌外毒素DT390基因的真核融合表达载体,并对其功能进行初步研究.方法 通过RT-PCR获得mMIP-1α基因,插入含DT390基因的真核质粒SRα,获得真核表达载体SRα-mMIP-1α-DT390.重组载体经PCR、限制性内切酶酶切及DNA序列测定鉴定,用PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,然后用免疫荧光技术检测目的蛋白的表达,并利用转染NIH3T3细胞后的培养上清体外测定mMIP-1α-DT390融合蛋白的选择性细胞毒活性.结果 成功构建真核表达质粒SRα-mMIP-1α-DT390,mMIP-1α-DT390融合蛋白可在NIH3T3细胞株中正确表达,细胞转染上清对小鼠活化T淋巴细胞具有较强的细胞抑制效应.结论 mMIP-1α-DT390融合基因真核表达载体的获得及功能的部分研究为进一步研究其抗炎效果和临床应用奠定基础.     

嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建嗜肺军团菌主要免疫原基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip,并观察其在真核细胞中的表达.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌ip基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1-ip.经限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ip转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot分别鉴定pcDNA3.1-ip的瞬时和稳定表达.结果 成功构建了嗜肺军团菌ip基因的真核表达重组质粒.在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA3.1-ip成功转入NIH3T3细胞,并在NIH3T3细胞中得到了瞬时表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA3.1-ip稳定转染的NIH3T3细胞,在相对分子质量为29×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-ip在细胞内可稳定表达IP蛋白.结论 本研究构建的嗜肺军团菌主要免疫原基因真核表达质粒pcDNA3.1-ip能够成功表达IP蛋白,表达的蛋白具有良好的免疫原性与免疫反应性.     

HEPC1和HEPC2真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,并观察其分别稳定转染NIH3T3细胞后的表达情况.方法从小鼠肝组织中分离总RNA,采用RT-PCR获得小鼠HEPC1和HEPC2基因全长cDNA,分别将其克隆至真核表达载体pcDNA3上,酶切和测序鉴定后,用脂质体将重组子分别转染至NIH3T3细胞中,G418进行长期筛选,然后用RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2的表达.结果RT-PCR获得预期大小的片段,重组子pcDNA3-HEPC1和pcDNA3-HEPC2酶切正确,测序表明HEPC1有1个碱基与GenBank中报告的不同,但其位于密码子的第3位在此不改变编码的氨基酸,HEPC2则完全与GenBank中报道的一致,经RT-PCR和dot-ELISA检测HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中均有表达.结论成功构建了小鼠HEPC1和HEPC2基因的真核表达载体,HEPC1和HEPC2在其稳定转染的NIH3T3细胞中获得了表达,为下一步探讨HEPC1和HEPC2的功能及作用机制奠定了基础.     

mIL-12重组逆转录病毒载体的构建及包装细胞系的建立

目的：构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法：将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果：重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论：包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。