过表达白血病相关蛋白16基因对前列腺癌ALVA41和DU145细胞增殖的影响

目的探讨过表达白血病相关蛋白16(LRP16)基因对人前列腺癌ALVA41和DU145细胞增殖的影响及其发生机制。方法2004-04～2005-10于解放军总医院用下列方法检测:(1)构建LRP16真核表达载体(pcDNA3.1-LRP16)并与对照空载体(pcDNA3.1)分别转染ALVA41和DU145细胞,将G418筛选获得的表达外源LRP16基因以及空载体的4组细胞(A16、A3.1、D16、D3.1)继续传代培养。(2)用四氮唑蓝染色(MTT)法测定并比较各组细胞的生长曲线。(3)提取两种细胞的总RNA,通过RT-PCR方法测定雌激素受体α(ERα)、雌激素受体β(ERβ)和雄激素受体(AR)在两种细胞中的表达。结果(1)LRP16过表达促进DU145细胞的生长,D16组在24、48、72、96和120h的细胞生长倍数分别是对照组(D3.1)的1.03倍(P>0.05)、1.10倍(P<0.05)、1.13倍(P<0.01)、1.63倍(P<0.01)和1.55倍(P<0.01)。(2)LRP16过表达对ALVA41细胞的生长无影响,A16组在24、48、72、96和120h的细胞生长倍数分别是对照组(A3.1)的0.998、1.040、0.944、1.018和1.036倍(P值均>0.05)。(3)ERα和ERβ在ALVA41、DU145两种细胞中均有表达。AR在ALVA41细胞中有表达,而在DU145细胞中无表达。结论过表达LRP16基因促进前列腺癌DU145细胞生长,但是其机制可能不是直接通过AR发挥作用。     

大黄素通过激活PPARγ促进HepG2细胞葡萄糖摄取

目的 构建PPARγ和PPARγ应答元件（PPRE）荧光素酶系统，并确定大黄单体成分大黄素是否能够通过激活PPARγ促进HepG2肝细胞葡萄糖摄取。方法 （1）构建PPARγ和PPRE荧光素酶系统并对20余种中药成分进行筛选；（2）将能够激活PPARγ和PPRE系统的大黄素与HepG2肝细胞进行培养，分别用RT-PCR／Southern杂交测定PPARγmRNA的表达；（3）用Western印迹法测定大黄素处理后的HepG2细胞的PPARγ和葡萄糖转运蛋白2（Glut2）的表达水平；（4）测定大黄素作用后的HepG2细胞对2-脱氧-[^3H]-D-葡萄糖摄取率。结果 （1）在筛查的中药成分中，大黄素作用24h后，呈剂量（0．04～180μmol／L）依赖性地增强COS-7细胞PPRE荧光素酶活性，其中90μmol／L浓度时达到最高值，为对照组的4倍（P〈0．01），而10μmol／L浓度的吡格列酮作用强度为对照组的6倍（P〈0．01）；（2）大黄素在90μmol／L浓度时刺激HepG2细胞PPARγmRNA表达水平增加2．7倍（P〈0．01）；（3）大黄素的作用呈剂量和时间依赖性地刺激HepG2细胞PPARγ和Glut2蛋白的表达水平。其中，PPARγ蛋白水平在90μmol／L和作用16h刺激作用最强，约为对照组的3．1—3．8倍（P〈0．01）；Glut2蛋白水平在90μmol／L和作用16h刺激作用最强，约为对照组的2．5—4．3倍（P〈0．01）；（4）HepG2细胞的葡萄糖摄取率在90μmol／L浓度的大黄素作用24h后，约为对照组的5倍（P〈0．01）。结论 研究结果显示大黄素刺激HepG2肝细胞PPARγ和Glut2蛋白表达，并促进葡萄糖的摄取。     

替米沙坦对脂多糖诱导3T3-L1脂肪细胞炎症通路的影响

目的 研究替米沙坦对脂多糖诱导3T1-L1脂肪细胞炎症通路的影响,探讨替米沙坦的抗炎机制.方法将3T3-L1脂肪细胞诱导至90%成熟,按随机数字表法分为6组:对照组、LPS组、LPS+替米沙坦(0.01、0.1、1和10μg/ml)组(n=18),向对照组细胞中加DMSO,LPS+替米沙坦组细胞中加入不同浓度替米沙坦,孵育2h后,LPS组和LPS+替米沙坦组再加入脂多糖(1 μg/ml),孵育1h,Western免疫印记法比较各组核蛋白NF-κBp65、总蛋白p-IκBα、IκBα、p-ERK1/2、ERK1/2、P-p38MAPK、p38 MAPK的表达水平.结果 脂多糖刺激后IκBα磷酸化蛋白表达增强(P＜0.05),细胞核内NF-κBp65蛋白表达增多(P＜0.05),MAPK通路相关蛋白ERK1/2磷酸化和p38MAPK磷酸化水平明显增强(P＜0.05),替米沙坦可抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核转位,p-IκBα蛋白表达和核蛋白NF-κBp65表达均降低,大剂量替米沙坦(10 μg/ml)作用时该作用明显(P＜0.05).替米沙坦干预后,p-ERK1/2和p-p38MAPK蛋白表达也受到明显抑制(P＜0.05),大剂量(10μg/ml)时作用明显(P＜0.05).结论 在3T3-L1脂肪细胞中,替米沙坦可以抑制NF-κB通路中IκBα蛋白磷酸化、NF-κBp65蛋白核转位以及MAPK通路中ERK1/2蛋白和p38MAPK蛋白的磷酸化,从而发挥抗炎作用.     

高表达垂体瘤转化基因通过p21抑制A549肺癌细胞的生长

垂体瘤转化基因 (ＰＴＴＧ)是从大鼠垂体瘤ＧＨ4细胞克隆出的一种肿瘤基因。ＰＴＴＧ在垂体泌乳素瘤的表达受雌激素的调控 ,其致肿瘤作用可能与刺激成纤维细胞生长因子(ＦＧＦ)和激活Ｃ Ｍｙｃ有关[1 ] 。此外 ,ＰＴＴＧ与抑制姐妹染色单体分离的ｓｅｃｕｒｉｎ序列一致[2 ] 。ＰＴＴＧｍＲＮＡ和蛋白质的表达水平呈细胞周期依赖性[3] 。因此 ,我们推测高表达ＰＴＴＧ有可能抑制某些肿瘤细胞的生长。材料与方法　材料 :肺癌Ａ549和子宫颈癌ＨｅＬａ细胞购自美国ＡＴＣＣ公司。ｐｌＲＥＳｎｅｏ表达质粒购自美国Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。抗ｐ2 …     

大黄酸改善糖尿病大鼠空腹血糖、胰岛素敏感性并增强肝脏PPARγ和GLUT-2的表达

目的 探讨大黄酸改善高脂喂养联合链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠血糖及肝脏胰岛素敏感性的作用及其可能机制.方法 (1)55只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC,n=15)和糖尿病组(DM,n=40).NC组以基础饲料喂养,DM组以高脂饲料喂养5周后给予一次性腹腔注射STZ(30ms/kg),其中30只成模大鼠再分为糖尿病模型组(DM-C)和糖尿病大黄酸治疗组(DM-T),后者即开始大黄酸灌胃(100 mg·kg-1·d-1),灌胃11周后处死动物,收集标本,记录体重、肝重,测定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆同醇(TC)、HbA1C、糖化血清蛋白(GSP)等生化指标,放射免疫法测定血清胰岛素浓度(FINS),计算胰岛素敏感指数(ISI)及稳态模型评估的胰岛素抵抗指数(HOMA-IR).(2)免疫组化法检测肝脏组织中PPARγ的表达,Western印迹法检测肝脏组织中葡萄糖转运蛋白2(GLUT-2)表达.结果 实验结束时,测得DM-C组FBG[(22.57±3.23 vs 7.11±1.44)mmoL/L,P<0.01]、TG[(0.89±0.29 vs 0.58±0.17)mmoL/L,P<0.01]、HbA1C[(12.49±1.96 138 8.36±0.84)%,P<0.01]、GSP[(57.29±4.14 vs13.43±2.70)μmol/L,P<0.01]和肿瘤坏死因子α[TNF-α,(1.365±0.133 vs 1.233±0.159)μg/L,P<0.05]较NC组均显著升高.DM-C组肝重指数亦明显高于NC组(0.032±0.004 vs 0.024±0.002,P<0.01),FINS与NC组无明显差别,ISI较NC组下降明显[In(ISI),-5.46±0.61 vs -4.81±0.75,P<0.05],HOMA-IR较NC组升高[In(HOMA-IR),2.34±0.64 vs 1.70±0.78,P<0.05].DM-C组肝脏PPARγ [11 131.7(5 723.1-18 979.4) vs 48 782.1(21 576.7-108 829.5),P<0.01]和GLUT-2(0.98±0.35vs 1.29±0.27,P<0.05)表达较NC组有明显下降趋势.而DM-T组大鼠的FBG[(15.94±3.16)mmol/L]、HbA1C[(10.51±1.74)%]和GSP[(47.31±6.09)μmol/L]、In(HOMA-IR)(1.86±0.30)等较DM-C组均显著降低(P<0.05或P<0.01),In(ISI)(-4.97±0.29)较DM-C组升高明显(P<0.05).肝脏PPARγ/[35 156.3(24 554.3-86 660.9)],GLUT-2(1.55±0.55)蛋白表达水平较DM-C组明显增强(P<0.05或P<0.01).结论 大黄酸可降低糖尿病大鼠血糖、HbA1C及GSP、改善糖尿病大鼠胰岛素敏感性,其机制可能与增强PPARγ、GLUT-2蛋白表达有关.     

软脂酸和花生四烯酸对人肝细胞瘤细胞株细胞葡萄糖摄取的影响

脂肪酸对人肝细胞瘤细胞株(HepG2)细胞葡萄糖摄取研究显示，高浓度的软脂酸可通过抑制HepG2细胞胰岛素受体和葡萄糖转运子2的表达抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取；花生四烯酸可通过类似机制刺激葡萄糖摄取，部分阻断软脂酸的作用。     

LRP16基因通过上调GLUT-2促进MIN6细胞胰岛素分泌

目的：探讨LRP16基因对MIN6细胞葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响及其可能机制。方法：用Super-Fect脂质体转染法建立稳定过表达LRP16基因的MIN6细胞株,以转染空质粒的MIN6细胞株作为对照。检测两组细胞的增殖、胰岛素分泌及GLUT-2蛋白的表达情况。结果：过表达组的增殖与对照组相比无显著差别（P〉0．05）;在0mmol／L、3mmol／L、30mmol／L葡萄糖刺激下,过表达组的胰岛素分泌量分别为对照组的2．26倍、2．19倍和2．16倍（P〈0．05）;westernblot显示过表达组GLUT-2蛋白量比对照组显著上调（P〈0．05）。结论：过表达LRP16基因不能促进MIN6细胞增殖,但可以通过上调GLUT-2促进胰岛素分泌。表明LRP16基因促进胰岛素分泌的作用不依赖细胞增殖,而依赖细胞对葡萄糖摄取的增加。     

全血贮存条件对离子交换高效液相色谱法检测HbA1c的影响

目的探讨不同温度、不同时段的贮存条件对全血HbA1c测定结果的影响。方法用离子交换高效液相色谱法检测全血HbA1c。取60例全血新鲜样本,每样本分装成15份,1份作为新鲜样本标准当天检测;5份4℃贮存,分别于3d、1周、2周、3周、4周后取出检测;3份-20℃、3份-40℃、3份-80％贮存,分别于1、3、6个月后取出检测,比较各个贮存条件下结果的平均值。结果4℃样本2周内的结果略高于当日结果2．5％左右,从第3周开始逐渐下降,第4周低于当日结果7．2％。-20℃、-40℃、3和6个月的结果都比当日结果低,且随时间延长有逐渐降低的趋势;除-80％冻存1个月的结果与当日结果差异无统计学意义（P〉0．05）外,其余各组结果与当日结果比较差异均有统计学意义（P〈0．05）。-80℃冻存1、3和6个月的结果都比当日结果略高,且随时间的延长结果略有升高,偏离当日结果的程度要比-20℃、-40℃偏离程度小。结论在相同温度条件下贮存时间越短贮存温度越低HbA1c越接近当日结果;贮存温度对结果的影响要比贮存时间更大。-80℃贮存1个月是本实验显示的最佳贮存条件。     

促肾上腺皮质激素单克隆抗体的筛选和鉴定

目的制备促肾上腺皮质激素 ( ACTH)单克隆抗体 ,拟建立高灵敏度 ACTH- IRMA或 EL ISA。方法 ACTH1 - 1 3、ACTH1 - 2 8、ACTH 1 - 39和 ACTH1 8- 39分别与牛血清白蛋白偶联制备免疫原 ,在背部皮下和腹腔注射免疫 BAL B/ c鼠。按常规方法进行细胞融合 ,以 RIA法检测培养上清液 ,阳性孔经亚克隆 ,获得 2株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株 ;瘤细胞种于预致敏的BAL B/ c鼠腹腔 ,批量生产单抗性腹水 ;琼脂扩散法鉴定抗体类型 ;利用标准曲线的参数计算单抗的亲合常数 ;亲合纯化单抗并进行抗体固化试验。结果从 ACTH1 - 2 8免疫鼠获得单抗株为 5 G2 ,从 ACTH1 - 1 3免疫鼠获得单抗株为 D3 ;单抗腹水 5 0 %结合率时腹水最终稀释度分别为 5× 10 3和 2× 10 3;抗体类型均为 Ig G1/λ;5 G2和 D3亲合常数分别为 5 .1× 10 9L M- 1 和 4 .9× 10 7L M- 1 ;抗体包被实验显示 5 G2和 D3的固化抗体量分别为 1.4μg和 8.8μg时结合率达到饱和。结论 5 G2和 D3可以用于构建灵敏的 ACTH- IRMA或 EL ISA。     

错配PCR致突变的实验条件研究

目的：对目前常用的致突菌株和PCR随机突变方法进行评价。方法：用单链抗体表达质粒转化致突菌株XL1-Red，转种传代7d，选取克隆测定DNA序列。用错配PCR在相同基因中引入突变，比较不同Mg^2 浓度、不同dNTP的浓度、不同dITP等条件下所致突变率。结果：在XL1－Red菌株中转种7d（约50代）后，测定突变率＜0.1%。在错配PCR中，增加Mg^2 浓度可提高突变率，增加dTTP和dCTP浓度的致突变效果优于增加dATP和dGTP的效果。在dITP配以低浓度的dATP或dGTP时突变率较低，使用5mmol/L MgCl2、0.5mmol/L MnCl2、1mmol/L dTTP和dCTP的条件下，经2轮PCR（共60个循环）突变率可＞2％。其突变类型有明显偏向性，以A／T的突变为主，转移多于颠换。结论：用致突菌株引入的突变率过低，不适用于抗体亲和力成熟，错配PCR在合适条件下可达到2％以上突变率，适用于随机突变抗体库的构建，但其突变类型有偏向性，应予以考虑。