三磷酸脱氧核苷对人外周血淋巴细胞和植物根尖细胞SCE影响的比较

目的：研究和比较4种三磷酸脱氧核苷（dNTP）对人外周血淋巴细胞和植物根尖细胞姐妹染色单体交换（SCE）的影响，探讨其发生的机理。方法：人外周血淋巴细胞和植物根尖细胞SCE。结果：4种dNTP中dGTP能显著诱导人外周血淋巴细胞和大麦及蚕豆根尖细胞SCE增加，且随着dGTP浓度的增加而增加。dATP能显著降低人外周血淋巴细胞和大麦及蚕豆根尖细胞的自发SCE发生频率，但其降低的SCE并不随着dATP浓度的增加而增加，而是当降低到一定程度后再增加dATP浓度并不能再降低SCE频率。dCTP和dTTP不影响人外周血淋巴细胞SCE，但能显著降低蚕豆根尖细胞的自发SCE发生频率，增加大麦根尖细胞自发SCE发生频率，且均呈剂量依赖性。在人外周血淋巴细胞中，dGTP对SCE的诱导能力完全被相同浓度的dATP和dCTP所抑制，但不受dTTP的影响。在植物中每种dNTP对SCE的诱导能力都可以被其它任何一种dNTP所抑制。相同浓度的4种dNTP混合处理不影响SCE的发生频率。续集：dNTP对人外周血淋巴细胞和植物根尖细胞SCE影响是不完全相同的，甚至在不同的植物中也表现不同。dNTP库的不平衡是影响SCE发生的一个因素，其影响可能是诱导SCE发生，也可能是降低SCE发生频率。单独一种dNTP改变会影响SEC，但这种影响可以被另一种dNTP抑制。4种dNTP保持平衡能保持SCE的低发生频率。     

RAPD扩增分枝杆菌DNA优化条件及菌型分型的诊断应用

目的探讨随机扩增多态性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技术在分枝杆菌分型诊断中优化条件及其应用价值。方法优化RAPD技术扩增分枝杆菌DNA的奈件，并分别扩增深圳市临床病人分离株DNA，对比RAPD电泳条带特征。结果以条带稳定、丰富、清晰为标准，确定引物1 RAPD最佳反应条件为：50出反应体系中，含100ng模板DNA，2．5mmol／L MgCl2，2U DNA聚合酶，引物0．5μmol／L，dATP、dGTP、dCTP和dTTP各250μmol／L，反应40个循环，每个循环为：94℃1min，36℃1min，72℃2min。所扩增结核杆菌临床分离株的DNA条带丰富、清晰，各条带差异较明显。结论RAPD技术能较好地鉴别MTB和NTM。     

大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用

目的评价大黄酸对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变作用。方法小鼠淋巴瘤细胞在代谢活化或非代谢活化条件下暴露于50、200、350、500μg/mL大黄酸3 h,处理后第2天将细胞接种于含有突变选择剂三氟胸苷的96孔板中,计数各剂量组的突变细胞集落数。通过计算第0天的相对存活率(relative survival,RS)、相对悬浮增长率(relative suspension growth,RSG)和相对总增长率(relative total growth,RTG)确定细胞毒性。用MUTANT软件包计算各种细胞毒性参数和突变率,并对突变率数据进行统计分析。结果在非代谢活化条件下,50、200、350、500μg/mL的大黄酸均未见诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加;在代谢活化条件下,大黄酸350μg/mL剂量组诱导L5178Y细胞的突变率增加,阳性对照组诱导的突变率显著增加。结论在非代谢活化条件下大黄酸各剂量组对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因无致突变作用;在肝微粒体酶系S9代谢活化条件下,出现了弱致突变性。     

镁离子对鼠角质细胞生长和分化的影响

利用无血清培养基培养角质细胞，研究Mg^2 对鼠角质细胞生长和分化的影响。实验结果表明，培养基中Mg^2 浓度为5．0mmol／L时，细胞贴壁率、克隆形成率明显增加，细胞分化比例和老化比例均达到最低。当Mg^2 浓度达到10．0mmol／L时，细胞增殖水平没有显著提高，角质细胞分化比例和老化比例却有一定程度的提高。培养基中加入一定浓度的Mg^2 能够刺激角质细胞的增殖，抑制角质细胞的分化，并且延缓细胞的老化。     

随机引物PCR检测人DNA指纹条件的优化

[目的]探讨随机引物PCR检测人DNA指纹技术的最优化条件。[方法]应用随机引物PCR技术，用一对经筛选的短引物，对扩增人DNA指纹的条件进行了优化。[结果]实验结果显示：DNA模板应新鲜，质量浓度在50－550mg/L1均有扩增产物，dNTP的浓度0.2mmol/L最宜。Mg^2 浓度5.0mmol/L效果最佳。循环参数以两个三步PCR，变性温度分别用94℃、90℃，时间各为30s，退火温度用43℃、48℃，时间分别为40s、50s，延伸温度为72℃，时间分别为1min、1min20s。[结论]按照优化的实验条件，得出的DNA指纹图重复性好，个体特异性高，为APHDF的推广提供了实验基础。     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V(16)A多态性的实验条件研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件．方法：对影响MnSOD基因PCR反应以及用限制性内切酶BsawI切割主要因素进行了系统研究．结果：最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15止体系中加8pL产物用2U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

RAPD的建立及优化研究

目的：建立优化的RAPD反应条件,为进一步进行遗传监控研究奠定基础。方法：按常规方法制备小鼠基因组DNA,在一定的RAPD－PCR反应条件下分别改变各组份浓度及退火温度。扩增产物在含溴化乙锭的1．5％琼脂糖凝胶中电泳,紫外透射仪上观察照相。结果：当Mg^2 浓度为1．5mmol/L,4种dNTPs各为150μmol/L,Taq酶为1．5U,引物为0．2mol/L,模板DNA为50ng,退火温度为38℃,RAPD－PCR扩增效果好。结论：在优化的条件下规范操作,RAPD的稳定性、重复性好。     

PCR-RFLP方法检测CCR5基因启动子区59029G/A多态性的实验研究

目的：确定PCR-RFLP技术检测CCR5基因启动子区59029G／A多态性的最适实验条件．方法：对主要影响因素设系列浓度梯度分别进行PCR后观察电泳结果。结果：最适变性温度为94℃；最适退火温度为60℃；最适引物浓度为0．4μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；以1．0U为最适Taq酶量．结论：酶切体系为20μL体系中加5μL产物用4U的酶消化，为后续研究奠定了实验基础．     

PCR-RFLP方法检测锰超氧化物歧化酶基因V（16）A多态性的实验条件研究（摘要）

目的为确定PCR-RFLP技术检测锰超氧化物歧化酶基因（MnSOD）V（16）A多态性的最适实验条件,对影响PCR的主要因素进行了研究.结果最适变性温度为95℃;最适退火温度为55℃；最适引物浓度为0．25μmol／L；最适Mg^2＋浓度为1．5mmol／L；最适dNTP浓度为0．20mmol／L；最适反应体系为25μL，以0．6U为最适Taq酶量．酶切体系为15μL体系中加8μL产物用2U的酶消化．为后续研究奠定了实验基础．     

无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性

目的：探讨无标记探针技术检测IL-6基因启动子单核苷酸多态性（SNP）的实用性．方法：采用新型荧光染料EvaGreen和无标记探针技术对IL-6基因启动子SNP进行基因分型．以其-597G〉A位点为例设计PCR扩增引物和无标记探针,按PCR扩增效率和产物特异性进行Mg^2＋浓度、不对称PCR引物比例以及模板浓度等条件的优化．并用此优化体系基因分型100例临床标本,杂合型与突变型以测序验证．结果：结果显示EvaGreen荧光PCR检测体系是最适Mg^2＋浓度为2．5mmol／L,不对称PCR引物比例为0．1／0．5umol／L,模板浓度为10ng／10uL的两步法不对称PCR．该体系对100例样本进行IL-6基因～597G〉A位点基因分型,发现7例杂合型和1例突变型,经测序与检测结果一致．结论：无标记探针技术检测基因SNP是一种值得推广的简便易行、低成本、常规化的基因分型方法．     

Role of Deoxyribonucleoside Triphosphates（dNTPs） in Cell Transformation

Dexoyribonucleoside triphosphate(dNTP)pools were measured in normal BALB/c3T3 cells,transformation-treated cells and transformed cells wit reverse-phase HPLC.The fluc tuation of dNTP pools was simiar after transformation treatment with alkylating mutagen glycidyl methacrylate(GMA)or Nmethyl-N‘-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG).However,the gap between deoxyguanosine triphosphate deoxydenosine triphosphate(dGTP dATP) pools and deoxythymidine triphosphate deoxycytidine triphosphate(dTTP dCTP)pools was greatly intensified.The measurements also indicated that the dNTP pools in transformed cells were quite different from those in normal cells.The results suggested that dNTP pools may play an important role in cell transformation.     

四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应在SNP基因分型中的研究

目的 探讨四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应(tetra-primer amplification refractory mutation system-potymerase chain reaction,tetra-primer ARMS-PCR)在SNP基因分型中的应用. 方法 利用人EXO1基因第10外显子CA9T单核苷酸多态性为研究对象,以tetra-primer ARMS-PCR的原理设计四种引物进行扩增,从而对Mg2 浓度、dN浓度、Taq酶用量及内外引物浓度比例4个因素进行优化. 结果 当反应体系的退火温度为51℃,Mg2 浓度、dNTP浓度分别为2.0 nanol/L、0.1 mmol/L,Taq酶用量为0.5 U,内/外引物浓度为1/0.2μmol/L时,tetra-primer ARMS-PCR应用于该SNP位点的基因分型结果最佳. 结论 四引物扩增受阻突变体系聚合酶链反应是SNP基因分型的一种可行方法,但在应用时需对反应条件进行必要的优化.     

不同镁离子浓度对TTV核酸检测的影响

目的 :确定输血传播病毒TTV核酸检测方法中的最佳镁离子浓度。方法 :根据TTVORF2区基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。结果 :在确定最佳引物浓度之后 ,分别建立不同镁离子浓度的PCR检测体系 ,根据反应曲线选择最佳镁离子浓度。结论 :最佳镁离子浓度应为 4 .0mmol/L。     

DNA与对氨基苯酚相互作用的初步研究

目的：探讨DNA与对氨基苯酚的相互作用。方法：在0．05mol／L Na2HPO4-0．05mol／L NaH2PO4-0．10mol／L NaCl缓冲体系（pH=7．30）中研究对氨基苯酚在核苷三磷酸修饰电极及DNA修饰电极上的电化学行为。结果：双链DNA（dsDNA）和单链DNA（ssDNA）均可减小对氨基苯酚的氧化峰峰电流，在三磷酸腺苷（dATP）、三磷酸鸟苷（dGTP）修饰电极上的电化学行为与之相似。结论：三磷酸腺苷（dATP）、三磷酸鸟苷（dGTP）和DNA与对亚氨基苯醌以较强的氢键结合，与对氨基苯酚作用力较小。     

Taqman—MGB荧光定量PCR测定饮用水中大肠菌群

目的建立饮用水中大肠菌群荧光定量PCR定量检测方法。方法以大肠菌群lacZ基因为靶基因,建立Taqman—MGB探针荧光定量PCR定量方法测定饮用水中大肠菌群,并进行方法学评价。结果25山荧光定量PCR反应体系中Mg3＋为5．0mmol／L,dNTPs0．2mmol／L,引物0．2μmol／L,探针0．5μmol／L,TaqDNA聚合酶2．0U,加入样品模板5μl。检测方法的特异性、重复性好,灵敏度高,可检出单个拷贝大肠菌群模板。结论所建立荧光定量PCR方法可快速、灵敏、特异检测饮用水中大肠菌群。     

随机引物PCR检测人DNA指纹条件的优化

【目的】探讨随机引物PCR检测人DNA指纹技术的最优化条件。【方法】应用随机引物PCR技术,用一对经筛选的短引物,对扩增人DNA指纹的条件进行了优化。【结果】实验结果显示DNA模板应新鲜,质量浓度在50～550mg/L均有扩增产物。dNTP的浓度0.2mmol/L最宜。Mg2+浓度5.0mmol/L效果最佳。循环参数以两个三步PCR,变性温度分别用94℃、90℃,时间各为30s,退火温度用43℃、48℃,时间分别为40s、50s,延伸温度用72℃,时间分别为1min、1min20s。【结论】按照优化的实验条件,得出的DNA指纹图重复性好,个体特异性高,为APHDF的推广提供了实验基础。     

EFFECT OF VL AND VH CONSENSUS SEQUENCE-SPECIFIC PRIMERS ON THE BINDING AND EXPRESSION OF A MINI- MOLECULE ANTIBODY DIRECTED TOWARDS HUMAN GASTRIC CANCER

Objective. To construct ScFv and Fab from murine anti-gastric cancer monoclonal antibody(mAb) 3H11.Methods. At first,3H11 ScFv and Fab were constructed with Ⅴ genes PCR amplified by degenerate primers for FR1 .The bacterial expressed 3H11 Ab fragments showed no antigen binding activity.Then,phage antibody library and random mutated library were constructed from 3H11 hybfidoma cells and panning selection was performed. Again the i-dentification of positive clone was failed. Finally the N-terminal sequences of Ⅴ regions were resumed to 3H11 original sequences by site-directed mutagenesis via PCR.Restdts. Binding activity to gastric cancer cells was detected only from N-terminal sequence corrected 3H11 ScFv and Fab, though the expression of the Ab fragments was not affected. Correction of either VL or VH N-terminal se-quences could partially resume the antigen binding activity. Conclusion. Sequence changes of Ⅴ region N terminal introduced by PCR may seriously affect antigen binding without affecting the expression of antibody.     

半巢式PCR检测FOXC2基因多态性实验条件研究

目的:研究半巢式PCR方法检测FOXC2基因5’非翻译区C-512T多态性的实验条件。方法:对实验研究中的主要影响因素设置各系列浓度和梯度,进行PCR反应后观察电泳结果,选取最适条件。结果:最适温度为58℃,最适Mg2+浓度为3.0mmol/L,最适dNTP浓度为2.5mmol/L。最适扩增循环为第一次扩增35个循环,第二次扩增30个循环。结论:摸索最适实验条件是进行批量实验的前提和关键。     

补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR条件优化

目的对补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系及扩增程序进行优化,检测PCR优化体系的适用性和灵敏性。方法通过改进引物设计、改变PCR反应过程中Mg2＋浓度、引物浓度、退火温度、模板DNA浓度及反应循环次数,分析比较PCR扩增效果。结果优化后的补体C3基因敲除小鼠基因型鉴定的PCR反应体系中,Mg2＋浓度在2-4mmol/L,引物浓度在0.025-0.4μmol/L,循环次数在30-45次之间均能扩增得到清晰均一的特异性条带;同时,引物退火温度在55.5℃-69.6℃范围内均适用;优化后PCR体系能够检测的最低DNA浓度为1.41ng/μl,即模板DNA在反应体系中的总量为约2.82ng.结论已经建立的优化后的PCR基因扩增体系特异性高且稳定可靠。     

结核分支杆菌扩增体系的建立、优化及评价

目的 建立并优化结核分支杆菌PCR反应扩增体系,并对所建立的体系进行评价。方法根据GenBank找到结核分支杆菌基因序列,在Primer Premier V5．0软件上设计结核分支杆菌特异性引物。并对反应体系中MgCl2、引物、dNTP浓度以及引物退火温度优化后建立结核分支杆菌PCR反应扩增体系。通过对,IB标准株、TB临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序、灵敏性试验以及特异性试验对PCR反应体系进行综合评估。结果TBPCR反应体系阳性扩增结果为在琼脂糖凝胶电泳上出现245bp的条带。Mga2、引物以及dNTP在TBPCR体系中优化后最佳终浓度分别为：4mmnol／L、0．04μmol／L以及0．3mmol／L。TBPCR体系的退火温度优化后为55℃。,IB标准株及11B临床分离株和临床阳性标本扩增产物的直接测序结果与GenBank中公布的序列完全一致。TBPCR反应体系对其它细菌无交叉反应。检测限度为10拷贝／止的DNA。结论TB PCR反应体系能够快速对TB标准株、TB临床分离株及临床标本进行结核分支杆菌的鉴别。